p66Shc deficiency in the Eμ-TCL1 mouse model of chronic lymphocytic leukemia enhances leukemogenesis by altering the chemokine receptor landscape

doi:10.3324/haematol.2018.209981

.2019年10月；104(10):2040-2052.

doi:10.3324/haematol.2018.209981。 Epub 2019年2月28日。

慢性淋巴细胞白血病Eμ-TCL1小鼠模型中p66Shc缺乏通过改变趋化因子受体景观促进白血病发生

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¹锡耶纳大学生命科学系patrussi2@unisi.it。
²锡耶纳大学生命科学系。
^三佛罗伦萨大学临床和实验医学系。
⁴锡耶纳锡耶纳大学人类生物技术系。
⁵的里雅斯特国际遗传工程和生物技术中心。
⁶帕多瓦威尼斯分子医学研究所。
⁷帕多瓦大学医学院医学、血液学和临床免疫学分院。
⁸欧洲肿瘤研究所，意大利米兰。
⁹锡耶纳大学生命科学系baldari@unisi.it。

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慢性淋巴细胞白血病Eμ-TCL1小鼠模型中p66Shc缺乏通过改变趋化因子受体景观促进白血病发生

劳拉·帕特鲁西等。血液学. 2019年10月.

.2019年10月；104(10):2040-2052.

doi:10.3324/haematol.2018.209981。 Epub 2019年2月28日。

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¹锡耶纳大学生命科学系patrussi2@unisi.it。
²锡耶纳大学生命科学系。
^三佛罗伦萨大学临床和实验医学系。
⁴锡耶纳大学人类生物技术系。
⁵的里雅斯特国际遗传工程和生物技术中心。
⁶帕多瓦威尼斯分子医学研究所。
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⁸意大利米兰欧洲肿瘤研究所。
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摘要

Shc家族适配器p66Shc作为B细胞受体触发的增殖和生存信号的负调节器，通过增强活性氧的产生，促进氧化应激依赖性细胞凋亡。此外，p66Shc控制调节淋巴细胞运输的趋化因子受体的表达和功能。慢性淋巴细胞白血病细胞具有p66Shc表达缺陷，这有助于其延长生存期并与不良预后相关。我们分析了p66Shc消融对慢性淋巴细胞白血病Eμ-TCL1小鼠模型疾病严重程度和进展的影响。我们发现Eμ-TCL1/p66Shc^-/-与Eμ-TCL1小鼠相比，小鼠患上了一种侵袭性疾病，发病时间更早，发病率更高，并导致更早死亡。Eμ-TCL1/p66Shc^-/-小鼠的淋巴结和结外部位都有大量的白血病细胞聚集。靶器官选择性与趋化因子受体上调相关，其配体在其中表达。这也适用于慢性淋巴细胞白血病细胞，其中趋化因子受体的表达和器官浸润程度与这些细胞的p66Shc表达水平呈负相关。在Eμ-TCL1小鼠中，p66Shc的表达随着疾病的进展而下降，并且可以通过使用Bruton酪氨酸激酶抑制剂ibrutinib来恢复。我们的结果强调了p66Shc缺乏是慢性淋巴细胞白血病进展和严重程度的一个重要因素，并强调了p66 Shc表达是相关的治疗靶点。

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数字

**图1。**
在白血病进展过程中，Eμ-TCL1小鼠肿瘤细胞中p66Shc的表达降低，并且可以通过ibrutinib治疗恢复。（A）定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）分析从四只野生型（WT）小鼠纯化的B1a、B1b、B2和总成熟B淋巴细胞以及从五只Eμ-TCL1病小鼠纯化的白血病细胞中的p66Shc mRNA。使用DDCt方法在三份样品上测定相对基因转录丰度，并将其归一化为*GAPDH公司*（B、E）。5只WT小鼠B淋巴细胞和Eμ-TCL1小鼠白血病细胞中p66Shc（B）和STAT4（E）mRNA的qRT-PCR分析⁺CD19编号⁺外周血细胞）（n=6）或显性白血病（≥50%CD5⁺CD19编号⁺细胞和白细胞计数>10.7x10⁶/mL外周血）（n=5）。使用DDCt方法在三份样品上测定相对基因转录丰度。（C）用WT（n=3）或Eμ-TCL1小鼠轻度白血病（n=3）或显性白血病（n=3）纯化的白血病细胞核后上清液的抗Shc和抗STAT4抗体进行免疫印迹分析。用抗肌动蛋白抗体重新处理剥离的过滤器。（D） CD5百分比之间的相关性⁺CD19编号⁺不同疾病阶段Eμ-TCL1小鼠外周血样本中p66Shc的mRNA水平（n=12）。（F）用二甲基亚砜（DMSO）孵育48小时的Eμ-TCL1病小鼠（n=4）脾脏纯化的白血病细胞中p66Shc（左）和STAT4（右）mRNA的qRT-PCR分析（细胞绝对存活率：膜联蛋白V的88.4±3.2%⁻/碘化丙锭⁻细胞）或1μM ibrutinib（绝对细胞活力：膜联蛋白V的84.9±2.9%⁻/碘化丙锭⁻细胞）。使用DDCt方法在三份样品上测定相对基因转录丰度。（G）用DMSO或1μM ibrutinib孵育48小时的Eμ-TCL1病小鼠（n=3）脾脏纯化的白血病细胞核后上清液的抗Shc和抗STAT4抗体进行免疫印迹分析。用抗肌动蛋白抗体重新处理剥离的过滤器。平均值±标准偏差。单向方差分析（ANOVA），多重比较。^*****P（P）*≤0.0001；^****P（P）*≤0.001;^***P（P）*≤0.01;^**P（P）*≤0.05

**图2。**
p66Shc缺乏加速Eμ-TCL1小鼠的白血病发生。CD5百分比（A）和白细胞（WBC）计数（B）的流式细胞术分析⁺CD19编号⁺Eμ-TCL1（n=87）或Eμ-TCL1/p66Shc外周血样本中的细胞^−/−在指定月份收集的（n=134）只小鼠。（C）根据CD5的月平均百分比计算的趋势线⁺CD19编号⁺Eμ-TCL1和Eμ-TCL1/p66Shc中的细胞^−/−小鼠如（A）所示。（D）疾病小鼠百分比分析，计算为CD5≥10%的小鼠百分比⁺CD19编号⁺细胞，根据CD5的百分比计算⁺CD19编号⁺单元格如（A）所示。（E） Eμ-TCL1或Eμ-TCL1/p66Shc的对数库生存分析^−/−小鼠如（A）所示。平均值±标准偏差。Mann-Whitney秩和检验。^*****P（P）*≤0.0001;^****P（P）*≤0.001;^***P（P）*≤0.01; ns：不显著。

**图3。**
白血病细胞中p66Shc缺乏导致化疗耐药性增强。（A）从野生型（WT）（n=7）或p66Shc纯化的白血病细胞中Bcl-2和Bax mRNA的实时定量聚合酶链反应分析^−/−（n=7）小鼠和Eμ-TCL1（n=10）或Eμ-TCL1/p66Shc^−/−（n=12）只显性白血病小鼠。使用DDCt方法在三份样品上测定相对基因转录丰度。（B）用WT（n=3）或p66Shc纯化的白血病细胞核后上清液的抗Bcl-2（左）和抗Bax（右）抗体进行免疫印迹分析^−/−（n=3）只小鼠和来自Eμ-TCL1（n=3）或Eμ-TCL1/p66Shc^−/−（n＝3）患有显性白血病的小鼠。用抗肌动蛋白抗体重新处理剥离的过滤器。（C）膜联蛋白V百分比的流式细胞术分析⁺CD5（CD5）⁺免疫球蛋白M⁺WT（n=9）或p66Shc外周血中的细胞^−/−（n=8）小鼠和Eμ-TCL1（n=20）或Eμ-TCL1/p66Shc小鼠^−/−（n=22）只小鼠。样品在37°C下用二甲基亚砜（DMSO）或35μM氟达拉滨（flu）处理16小时。（D）膜联蛋白V百分比的流式细胞术分析⁺CD5（CD5）⁺免疫球蛋白M⁺来自Eμ-TCL1（n=20）或Eμ-TCL1/p66Shc的外周血细胞^−/−（n=22）CD5<35%（黑盒）或≥35%（灰盒）的小鼠⁺CD19编号⁺外周血中的白血病细胞，在37°C下用二甲基亚砜或35μM氟达拉滨处理16小时。平均值±标准偏差。单向方差分析（ANOVA），多重比较。^*****P（P）*≤0.0001;^****P（P）*≤0.001; ***P（P）*≤0.01; **P（P）*≤0.05

**图4。**
缺乏p66Shc的白血病细胞的结节和结外积聚。CD5百分比的（A-D）（左）流式细胞术分析⁺CD19编号⁺来自Eμ-TCL1（n=15）或Eμ-TCL1/p66Shc的淋巴结（A）、肝脏（B）、肺（C）和腹腔冲洗液（D）中的细胞^−/−（n=15）患显性白血病的小鼠。（右）Eμ-TCL1（n=5）或Eμ-TCL1/p66Shc淋巴结（A）、肝脏（B）、肺（C）和腹腔冲洗液（D）中B220（下面板）的苏木精和伊红染色（上面板）和免疫组织化学分析^−/−（n=10）患有显性白血病。（免疫过氧化物酶染色；原始放大，5倍、10倍和20倍）。平均值±标准偏差。Mann-Whitney秩和检验。^*****P（P）*≤0.0001;^****P（P）*≤0.001;^***P（P）*≤0.01.

**图5。**
白血病细胞中p66Shc缺乏导致归巢受体表达增强，出口受体S1PR1表达降低。（A-E）CD5中CXCR4（A）、CCR7（B）、S1PR1（C）、CCR2（D）和CXCR3（E）的mRNA水平的定量实时聚合酶链式反应分析（左）和表面表达的流式细胞术分析（右）⁺CD19编号⁺从野生型（WT）（n=16）或p66Shc纯化的细胞^−/−（n=15）小鼠（B1a细胞）和Eμ-TCL1（n≥16）或Eμ-TCL1/p66Shc^−/−（n≥16）显性白血病小鼠。使用DDCt方法在一式三份的样品上测定相对基因转录物丰度。右侧显示了所示斑点的代表性流式细胞仪图。对相应趋化因子的趋化作用如所示*在线补充图S6*平均值±标准偏差。单向方差分析（ANOVA），多重比较。^*****P（P）*≤0.0001;^****P（P）*≤0.001;^***P（P）*≤0.01;^**P（P）*≤0.05。

**图6。**
p66Shc缺乏与人类慢性淋巴细胞白血病中趋化因子受体的异常表达和淋巴结病有关。（A，B）定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）分析从健康献血者（HD）（n=12）或慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者（n=157）（A）或从CLL患者（分为突变CLL（M-CLL）（n=67）或未突变CLL的B细胞中纯化的B细胞的p66Shc mRNA（n=64）（B）。（C-G）CLL患者B细胞（n≤89）中p66Shc mRNA水平与CCR7（C）、S1PR1（D）、CXCR4（E）、CCR2（F）和CXCR3（G）表面表达水平的相关性。（H）纯化的CLL B细胞（n=6）中CCR2（左）和CXCR3（右）mRNA的qRT-PCR分析，用空载体（CLL vect）或编码p66Shc的表达结构进行核感染（CLL p66）。使用DDCt方法在三份样品上测定相对基因转录丰度。平均值±标准偏差。Mann-Whitney秩和检验。^****P（P）*≤0.001“至”^*****P（P）*≤0.0001;^****P（P）*≤0.001”.

**图7。**
p66Shc的抗氧化活性调节CCR2和CXCR3的表达。（A，C）从健康供体（HD，n=7）或慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者纯化的B细胞中活性氧（ROS）产生的流式细胞术分析，根据其是否具有突变的CLL（M-CLL）（n=11）或未突变的CLL（UM-CLL）（n=9）进行分组（A），以及从野生型B1a细胞（C57BL/6，n=9）小鼠和Eμ-TCL1（n=13）或Eμ-TCL1/p66Shc^−/−（n=12）病鼠（C），负载CM-H₂DCFDA。数据是指每个患者/供体/小鼠的重复样本。（B） CLL患者B细胞中p66Shc mRNA水平与ROS生成的相关性（n=28）。（D，E）用空载体（ctr）或编码野生型p66Shc（p66）或EE132/133QQ（p66QQ）突变体的表达结构稳定转染的MEC1 B细胞和从健康供体（HD）纯化的B细胞中的Shc表达的免疫印迹分析（D）和p66ShcmRNA（E）的定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）分析（n=3）。剥离过滤器的对照抗肌动蛋白印迹如下所示。指出了分子质量标记的迁移。p66Shc的结构域显示了突变体中被取代的氨基酸残基的定位，如面板顶部所示。（F）流式细胞术分析MEC1 B细胞转染体和从携带CM-H的健康供体（B细胞，n=5）纯化的B细胞中ROS的产生₂DCFDA。数据是指来自五个独立实验的重复样本。（G，I）。MEC1转染剂中CCR2（左）和CXCR3（右）mRNA水平（I）的流式细胞术分析（G）和qRT-PCR分析。数据是指来自五个独立实验的重复样本。（H，J）。流式细胞术分析（H）和qRT-PCR分析用二甲基亚砜（DMSO）或50μM H处理24 H的MEC1细胞中CCR2和CXCR3的mRNA水平（J）₂O（运行）₂数据是指来自四个独立实验的重复样本。使用ΔΔCt方法在三份样品上测定相对基因转录丰度。平均值±标准偏差。Mann-Whitney秩和检验。^*****P（P）*≤0.0001;^****P（P）*≤0.001^***P（P）*≤0.01;^**P（P）*≤0.05. MFI：平均荧光强度。

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中的注释

p66Shc缺乏为临床侵袭性慢性淋巴细胞白血病创造了条件。
罗森奎斯特·R。罗森奎斯特·R。血液学。2019年10月；104(10):1914-1916. doi:10.3324/haematol.2019.225904。血液学。2019 采购管理信息：31575671 免费PMC文章。没有可用的摘要。

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