Mitochondrial superoxide disrupts the metabolic and epigenetic landscape of CD4+ and CD8+ T-lymphocytes

doi:10.1016/j.redox.2019.101141

.2019年10月：27:101141。

doi:10.1016/j.redox.2019.101141。 Epub 2019年2月21日。

线粒体超氧化物破坏CD4的代谢和表观遗传景观⁺和CD8⁺T淋巴细胞

C M Moshfegh公司¹, C W柯林斯¹, V冈达², 瓦桑塔库玛^三, J Z曹^三, P K辛格², L A戈德利^三, Adam J案件⁴

附属公司

¹内布拉斯加州大学医学中心细胞和综合生理学系，美国东北部奥马哈。
²内布拉斯加州大学医学中心爱普雷癌症及相关疾病研究所，美国东北部奥马哈。
^三美国伊利诺伊州芝加哥市芝加哥大学医学综合癌症中心医学部血液/肿瘤科。
⁴内布拉斯加州大学医学中心细胞和综合生理学系，美国东北部奥马哈。电子地址：adam.case@unmc.edu。

采购管理信息： 30819616
预防性维修识别码： PMC6859572型
内政部： 2016年10月10日/j.redox.2019.10141

线粒体超氧化物破坏CD4的代谢和表观遗传景观⁺和CD8⁺T淋巴细胞

C M Moshfegh公司等。氧化还原生物. 2019年10月.

.2019年10月：27:101141。

doi:10.1016/j.redox.2019.101141。 Epub 2019年2月21日。

作者

C M Moshfegh公司¹, C W柯林斯¹, V冈达², 瓦桑塔库玛^三, J Z曹^三, P K辛格², L A戈德利^三, Adam J案件⁴

附属公司

¹内布拉斯加州大学医学中心细胞和综合生理学系，美国东北部奥马哈。
²内布拉斯加州大学医学中心爱普雷癌症及相关疾病研究所，美国东北部奥马哈。
^三美国伊利诺伊州芝加哥市芝加哥大学医学综合癌症中心医学部血液/肿瘤科。
⁴内布拉斯加州大学医学中心细胞和综合生理学系，美国东北部奥马哈。电子地址：adam.case@unmc.edu。

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摘要

虽然线粒体代谢在控制T淋巴细胞活化和功能中的作用越来越明确，但线粒体氧化还原信号如何促进T淋巴细胞调节的细节仍不清楚。在这里，我们检测了线粒体超氧化物（O₂^-)利用诱导性锰超氧化物歧化酶（MnSOD）敲除的新模型研究T淋巴细胞活化。MnSOD的缺失导致线粒体O的特异性增加₂^-过氧化氢（H）无明显变化₂O（运行）₂)，过氧亚硝酸盐（ONOO^-)，或铜/锌超氧化物歧化酶（CuZnSOD）水平。出乎意料的是，线粒体和糖酵解代谢均显示出基线、最大容量和ATP生成量显著降低，线粒体O增加₂^-水平。MnSOD敲除的T淋巴细胞表现出异常激活，包括细胞因子产生的广泛失调和细胞凋亡增加。有趣的是，在MnSOD敲除的T淋巴细胞中，由细胞周期调节基因显著上调所定义的增殖特征升高也很明显，但这些细胞没有显示出加速的增殖率。随着线粒体O增加，还观察到T淋巴细胞DNA甲基化和羟甲基化的整体破坏₂^-这与蛋氨酸循环相关的细胞内代谢物池的变化有关。综上所述，这些结果表明线粒体氧化还原和代谢偶联在被破坏时可能会改变T淋巴细胞适当活化所必需的细胞过程。

关键词：适应性免疫；细胞凋亡；细胞因子；羟甲基化；免疫；锰超氧化物歧化酶；代谢；甲基化；氧化应激；增殖；氧化还原。

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数字

图1
**使用诱导型敲除策略有效去除T淋巴细胞中的MnSOD**三苯氧胺用于MnSOD敲除（Cre^+/-)和控制（Cre^−/-)小鼠连续五天，然后两周，让MnSOD完全重组和丢失。从小鼠中分离出脾T淋巴细胞，并对其幼稚或活化状态进行分析（与抗CD3和抗CD28珠培养96 h）状态。A类.左侧、MnSOD基因和*正确的*定量实时RT-PCR评估CuZnSOD基因mRNA水平。B.左侧MnSOD和CuZnSOD的代表性western blot。赖特、各蛋白质的定量。C类.左侧MnSOD和CuZnSOD的代表性活性凝胶。赖特、各蛋白质的定量#第页 < 0.01与单纯Cre^−/-; *与激活的Cre相比，p<0.01^负极/-通过参数Student t检验或非参数Mann-Whitney单位适当时进行测试。

图2
**MnSOD的损失特别增加了稳态O**₂^•-**T淋巴细胞。**三苯氧胺用于MnSOD敲除（Cre^+/-)和控制（Cre^−/-)小鼠连续五天，然后两周，让MnSOD完全重组和丢失。从经抗CD3和抗CD28珠激活的小鼠中分离出脾T淋巴细胞，培养96个 小时。A类Cre的典型电子顺磁共振谱^−/-和克里^±老鼠。量化位于插图中。此外，流式细胞术荧光定量二氢乙硫啶染色（DHE）检测总细胞O₂^•-(B)，线粒体O的MitoSOX红染色₂^•-(C类)，细胞总H的PY1染色₂O（运行）₂和ONOO⁻(D类)线粒体H的MitoPY1染色₂O（运行）₂和ONOO⁻(E类). *与激活的Cre相比，p<0.01^−/-通过参数Student t检验或非参数Mann-Whitney单位适当时进行测试。

图3
**线粒体O**₂^•-**破坏T淋巴细胞的线粒体和糖酵解代谢。**三苯氧胺用于MnSOD敲除（Cre^+/-)和控制（Cre^−/-)小鼠连续五天，然后两周，以允许MnSOD的完全重组和损失。从小鼠中分离出脾T淋巴细胞，并对其幼稚或活化状态进行分析（与抗CD3和抗CD28珠培养96 h）状态。A类.上部线粒体应激试验的代表性耗氧率（OCR）曲线。彩色线条对应以下量化中的颜色编码。下部，代谢状态的量化。数字对应于上述代表性曲线上的各个时间点或计算。B.上部，糖酵解应激试验的代表性细胞外酸化率（ECAR）曲线。彩色线条对应以下量化中的颜色编码。下部，代谢状态的量化。数字对应于上述代表性曲线上的各个时间点或计算#第页 < 0.01与单纯Cre^−/-; *与激活的Cre相比，p<0.01^−/-通过双向方差分析，进行多重比较和Bonferroni事后分析。

图4
**MnSOD的缺失增加了T淋巴细胞的凋亡，同时增加了增殖能力。**三苯氧胺用于MnSOD敲除（Cre^+/-)和控制（Cre^−/-)小鼠连续五天，然后两周，让MnSOD完全重组和丢失。从小鼠中分离出脾T淋巴细胞，并对其幼稚或活化状态进行分析（与抗CD3和抗CD28珠培养96 h）状态。A类T淋巴细胞在不同时间点的生长曲线。N个 = 6B通过膜联蛋白V（AV）和碘化丙啶（PI）染色对凋亡部分进行流式细胞术定量。AV-/PI-表示健康、有活力的细胞；AV+/PI-提示早期凋亡细胞；AV+/PI+表示晚期凋亡/坏死细胞。C类CFSE染色的流式细胞术定量。开放直方图表示染色的预激活细胞，而阴影直方图显示96后的细胞 激活h。Y轴设置为模态视图以进行比较。D类利用细胞内碘化丙啶染色对细胞周期进行流式细胞术定量。N个 = 6E类各种细胞周期基因定量实时RT-PCR分析的热图表示。每个单独的正方形代表一个生物复制品。N=5*与激活的Cre相比，p<0.01^−/-通过参数Student t检验，非参数Mann-Whitney单位测试，或使用Bonferroni事后分析进行双向方差分析。

图5
**整体细胞因子和趋化因子失调与稳态线粒体O增加有关**₂^•-**T淋巴细胞。**三苯氧胺用于MnSOD敲除（Cre^+/-)和控制（Cre^−/-)小鼠连续五天，然后两周，让MnSOD完全重组和丢失。从培养的抗CD3和抗CD28珠激活的小鼠中分离出脾T淋巴细胞。利用培养基进行细胞因子和趋化因子分析。**A、 B、C、D、F、G、H**48和96岁时各种分泌细胞因子的细胞计量珠阵列分析 h激活后。**E、 I，J。**96岁时各种细胞因子和趋化因子的中尺度复合阵列 h激活后。黑色圆圈表示Cre^−/-，而蓝色三角形表示Cre^+/-数据显示为在相应时间点的单元格编号*与激活的Cre相比，p<0.01^−/-通过参数Student t检验，非参数Mann-Whitney单位测试，或使用Bonferroni事后分析进行双向方差分析。

图6
**线粒体O升高**₂^•-**破坏T淋巴细胞代谢-表观遗传轴**三苯氧胺用于MnSOD敲除（Cre^+/-)和控制（Cre^−/-)小鼠连续五天，然后两周，让MnSOD完全重组和丢失。从小鼠中分离出脾T淋巴细胞，并对其幼稚或活化状态进行分析（与抗CD3和抗CD28珠培养96 h）状态。A类全局DNA胞嘧啶甲基化（5mdC）和羟甲基化（5hmdC）显示为幼稚T淋巴细胞总核苷酸的百分比。B全局DNA胞嘧啶甲基化（5mdC）和羟甲基化（5hmdC）显示为活化T淋巴细胞中总核苷酸的百分比。C类通过定量实时RT-PCR评估TET基因mRNA水平。D类DNA甲基化蛋氨酸循环示意图。S-腺苷蛋氨酸（SAMe）的靶向细胞内代谢组学分析；E类)S-腺苷同型半胱氨酸（SAH；F类)，SAMe/SAH比率(**G公司**)总谷胱甘肽（GSH）；**H（H）**)，甲硫氨酸亚砜（Met-Ox；我)和腺苷(J型). *与激活的Cre相比，p<0.01^−/-通过参数Student t检验，非参数Mann-Whitney单位测试，或使用Bonferroni事后分析进行双向方差分析。

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