Continuous exposure of isoprenaline inhibits myoblast differentiation and fusion through PKA/ERK1/2-FOXO1 signaling pathway

doi:10.1186/s13287-019-1160-x

.2019年2月28日；10(1):70.

doi:10.1186/s13287-019-1160-x。

持续暴露异丙肾上腺素通过PKA/ERK1/2-FOXO1信号通路抑制成肌细胞分化和融合

陈绍娟^1 2, 景悦¹, 张静轩^三 4, 苗江¹, 屠强虎⁵, 魏东冷², 李翔^1 三, 李新源¹, 张磊（Lei Zhang）^1 4, 费正¹, 叶媛¹, 郭林云^1 4, 亚穆·潘¹, 于文燕¹, 王佳宁^1 4, 陈世友⁶, 唐君铭^7 8 9

附属公司

¹湖北医科大学人民医院心内科和临床医学研究所，湖北省十堰市，442000，中华人民共和国湖北省。
²湖北医科大学泰和医院口腔科，十堰，442000，湖北，中华人民共和国。
^三湖北医科大学基础医学院生理学系，十堰，442000，湖北，中华人民共和国。
⁴湖北医科大学生物医药研究所、湖北省人类胚胎干细胞重点实验室，十堰，442000，湖北，中华人民共和国。
⁵湖北医科大学人民医院口腔科，十堰，442000，中华人民共和国湖北。
⁶美国雅典乔治亚大学生理药理学系，GA30602。
⁷湖北医科大学人民医院心内科和临床医学研究所，湖北省十堰市，442000，中华人民共和国湖北省。tangjm416@163.com。
⁸湖北医科大学基础医学院生理学系，十堰，442000，湖北，中华人民共和国。tangjm416@163.com。
⁹湖北医科大学生物医药研究所、湖北省人类胚胎干细胞重点实验室，十堰，442000，湖北，中华人民共和国。tangjm416@163.com。

PMID： 30819239
预防性维修识别码： PMC6394105型
内政部： 10.1186/s13287-019-1160-x

持续暴露异丙肾上腺素通过PKA/ERK1/2-FOXO1信号通路抑制成肌细胞分化和融合

陈绍娟等。干细胞研究与治疗. 2019.

.2019年2月28日；10(1):70.

doi:10.1186/s13287-019-1160-x。

作者

陈绍娟^1 2, 景悦¹, 张静轩^三 4, 苗江¹, 屠强虎⁵, 魏东冷², 李翔^1 三, 李新源¹, 张磊（Lei Zhang）^1 4, 费正¹, 叶媛¹, 郭林云^1 4, 鸭母盘¹, 于文燕¹, 王佳宁^1 4, 陈世友⁶, 唐君铭^7 8 9

附属公司

¹湖北医科大学人民医院心内科和临床医学研究所，湖北省十堰市，442000，中华人民共和国湖北省。
²湖北医科大学泰和医院口腔科，十堰，442000，湖北，中华人民共和国。
^三湖北医科大学基础医学院生理学系，十堰，442000，湖北，中华人民共和国。
⁴湖北医科大学生物医药研究所、湖北省人类胚胎干细胞重点实验室，十堰，442000，湖北，中华人民共和国。
⁵湖北医科大学人民医院口腔科，十堰，442000，湖北，中华人民共和国。
⁶美国雅典乔治亚大学生理药理学系，GA30602。
⁷湖北医科大学人民医院心内科和临床医学研究所，湖北省十堰市，442000，中华人民共和国湖北省。tangjm416@163.com。
⁸湖北医科大学基础医学院生理学系，十堰，442000，湖北，中华人民共和国。tangjm416@163.com。
⁹湖北医科大学生物医药研究所、湖北省人类胚胎干细胞重点实验室，十堰，442000，湖北，中华人民共和国。tangjm416@163.com。

PMID： 30819239
预防性维修识别码： PMC6394105型
内政部： 10.1186/s13287-019-1160-x

摘要

目标：本研究的目的是确定丰富的交感神经活动是否参与肌肉卫星细胞分化和成肌细胞融合。

方法和结果：通过免疫分析和western blot分析，我们发现β1和β2-肾上腺素能受体（AdR）在C2C12细胞中表达。与增殖细胞相比，分化的卫星细胞的β2-AdR表达增加。β-AdR激动剂异丙肾上腺素（ISO）持续暴露，延迟C2C12细胞分化，成肌细胞融合呈时间和剂量依赖性。ISO还增加了短肌管数量，而减少了长肌管数量。这与MyHC1、MyHC2a和MyHC2x表达的减少幅度较大一致。此外，持续接触ISO逐渐降低PKA RI/RII的比率，PKA RI激活剂有效地逆转了ISO对C2C12细胞分化和成肌细胞融合的影响，而PKA抑制剂H-89则恶化了这种影响。连续单剂量ISO增加了C2C12细胞中β1-AdR的表达。更重要的是，细胞表现出增强的磷酸-ERK1/2水平，导致磷酸-β2-AdR水平增加，而β2-AdR水平降低，并且ERK1/2抑制剂可以消除这种特异性作用。此外，持续接触ISO可诱导FOXO1核移位，增加核提取物中FOXOl的水平，同时降低pAKT、p-p38MAPK和pFOXOI的水平。相反，阻断ERK1/2信号部分消除ISO对AKT、p38MAPK和FOXO1信号的影响，从而部分恢复C2C12细胞分化和成肌细胞融合，导致中肌管数量增加，MyHC1和MyHC2a表达增加。

结论：ISO的持续暴露至少部分通过PKA-ERK1/2-FOXO1信号通路阻碍卫星细胞分化和成肌细胞融合，这与β2-AdR水平降低和β1-AdR水平升高有关。

关键词：肾上腺素能受体；区别；ERK1/2；FOXO1；异丙肾上腺素；成肌细胞融合；PKA。

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不适用。

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不适用。

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数字

图1
连续单剂量ISO剂量依赖性抑制C2C12细胞分化和成肌细胞融合。一用免疫荧光染色法观察不同剂量ISO对分化C2C12细胞MyHC阳性肌纤维的典型影响。红色表示分化的C2C12细胞中相应的MyHC表达；蓝色表示DAPI标记的细胞核。b条-**c（c）**c通过实时PCR卫星细胞分化标记物MyoD和MyoG，测定不同剂量ISO对C2C12细胞分化的影响。^$*P（P）*=0.0051对Ctrl；^#*P（P）*=0.0047 vs.10^-8个M ISO^*P（P）*=0.0263对10^-7M ISO**P（P）*=0.0033与10^-6M等；^@*P（P）*=0.0863对10^-8个M ISO；n个= 6.d日-如果Western blot检测上述蛋白水平，进一步证实连续单剂量ISO刺激后C2C12细胞分化抑制的特征。α-微管蛋白作为内部对照。^$*P（P）*=0.0048对Ctrl；^#*P（P）*=0.0039 vs.10^-8个M ISO；^&*P（P）*=0.0054与10^-7M ISO*=0.0196与10^-6M ISO^*P（P）*=0.0679对10^-6M ISO；n个= 6

图2
连续单剂量ISO时间依赖性延迟C2C12细胞分化和成肌细胞融合。一通过MyHC的免疫荧光染色测定C2C12细胞分化后第2天、第4天和第6天在有或没有连续单剂量ISO刺激的情况下的成肌细胞融合的典型图像。绿色表示MyHC；蓝色表示DAPI用于核标记。b条连续单剂量ISO显著降低C2C12细胞分化后第2天MyHC阳性细胞的数量**P（P）*=0.0000与Ctrl。**c（c）**连续单剂量ISO可显著减少C2C12细胞分化后第4天5个以上成肌细胞融合的肌管数量**P（P）*=0.0000与Ctrl。d日连续单剂量ISO可显著减少C2C12细胞分化后第6天5个以上成肌细胞融合的肌管数量**P（P）*=0.0000与Ctrl

图3
连续单剂量ISO改变了肌肉纤维类型。一通过实时PCR检测不同剂量ISO对分化C2C12细胞中Ⅰ型肌纤维标记物MyHC1 mRNA水平的抑制作用。b条-d日II型肌纤维制造商，如MyHC2a、MyHC2b和MyHC2x，在连续单剂量ISO刺激分化C2C12细胞的mRNA表达后，显示分化C2C11细胞中mRNA表达的变化减少。^$*P（P）*=0.0000对Ctrl；^#*P（P）*=0.00368对10^-8个M ISO；^&*P（P）*=0.0826对10^-7M ISO**P（P）*=0.0004对10^-6M ISO；n个= 6

图4
连续单剂量ISO通过改变β-AdR延迟C2C12细胞分化和成肌细胞融合。一免疫荧光染色检测增殖或分化C2C12细胞中β1-AdR和β2-AdR表达的典型图像。绿色表示C2C12细胞中相应的AdR表达；蓝色表示DAPI标记的细胞核。b条-**c（c）**经Western blot检测，分化的C2C12细胞与增殖细胞相比，β2-AdR水平增加，但作为内部对照的β1-AdRα-微管蛋白无差异**P（P）*=0.0019 vs.增殖的C2C12细胞；n个= 3.d日-如果Western blot检测了在连续单剂量ISO刺激下，分化的C2C12细胞中β1-AdR和pβ2-AdR增加而β2-AdR减少的特征。α-微管蛋白作为内部对照。^@*P（P）*=0.00014对Ctrl；^#*P（P）*=0.0004对10^-8个M ISO；^&*P（P）*=0.0002对10^-7M ISO**P（P）*=0.0016与10^-6M等；n个= 3.克MyHC免疫荧光染色确定的成肌细胞融合的典型图像。红色表示MyHC；蓝色表示DAPI用于核标记。小时连续单剂量ISO可降低C2C12细胞分化后第6天5个以上成肌细胞融合的肌管数，同时增加小于5个成肌细胞的融合肌管数。β1-AdR抑制剂CPG-20712（10^-7M） ●●●●。^&*P（P）*=0.0005对Ctrl；^$*P（P）*=0.0012对10^-5M ISO；n个= 3

图5
连续单剂量ISO通过改变PKA RI/RII的比值延迟C2C12细胞分化和成肌细胞融合。一通过Western blot检测连续单剂量ISO处理的C2C12细胞中指示蛋白的表达。α-微管蛋白作为内部对照。b条-**e（电子）**作为PKA不同亚型谱带强度的半定量分析，连续单剂量ISO可显著降低C2C12细胞中PKA-RIα和PKA-RI-β的水平，同时增加PKA-RIIα的水平。PKA RI/RII表达PKA RIα+PKA RI-β与PKA RIIα带强度的比值。^#*P（P）*<0.001与其他组相比；^&*P（P）*=0.0014与10^-8个M ISO；^$*P（P）*=0.0005对10-7M ISO**P（P）*=0.0019对10-6M ISO；n个= 3.如果连续单剂量ISO诱导C2C12细胞分化为有或无PKA RI激活物N的成肌细胞融合的典型图像⁶-Bz-cAMP（10^-4M）或PKA抑制剂H-89（10^-7M）通过MyHC免疫荧光染色测定。绿色表示MyHC；蓝色表示DAPI用于核标记。克PKA RI激活剂部分消除了连续单剂量ISO对C2C12细胞分化的抑制作用，而PKA抑制剂则恶化了其作用。^&*P（P）*=0.0004对Ctrl；^$*P（P）*=0.0007对10^-5M ISO**P（P）*<0.05与10^-5M ISO；^#*P（P）*=0.0016 vs.N⁶-Bz-cAMP；n个= 3

图6
连续单剂量ISO对参与ERK1/2信号传导的β2-AdR的灭活。一western blot检测指示蛋白的表达。α-微管蛋白作为内部对照。b条-**e（电子）**通过将图6a中所示蛋白归一化为相应的总蛋白，对图6a所示蛋白进行半定量分析，显示连续单剂量ISO处理的C2C12细胞中pERK1/2增加，pAKT和p38MAPK减少。^#*P（P）*=0.0101 vs.Ctrl或10^-8个M ISO；^&*P（P）*=0.0003对10^-7M ISO**P（P）*=0.0068对10^-6M ISO；n个= 3.如果-我连续单剂量ISO降低β2-AdR水平，同时增加pβ2-AdR水平，PD98059（5х10^-5M）经western blot测定。^&*P（P）*=0.0014对Ctrl**P（P）*=0.0008对10^-5M ISO；n个= 3

图7
ERK1/2介导的β2-AdR失活参与C2C12细胞分化和成肌细胞融合。一-b条连续单剂量ISO降低MyHC表达，western blot检测PD98059可部分消除这种特异性作用。^&*P（P）*=0.0016对Ctrl**P（P）*=0.0011对10^-5M ISO；n个= 3.c（c）MyHC免疫荧光染色确定的成肌细胞融合的典型图像。绿色表示MyHC；蓝色表示DAPI用于核标记。d日-如果PD98059明显消除了连续单剂量ISO对C2C12细胞分化产生的MyHC阳性肌管数量的影响。^&*P（P）*=0.002对Ctrl；^$*P（P）*<0.05与10^-5M ISO**P（P）*=0.0014与10^-5M ISO；^@*P（P）*=0.041对10^-5M ISO；n个= 6.克-我PD98059部分消除了ISO对C2C12细胞分化产生的不同长度肌管数量的影响。^&*P（P）*=0.0000相对于Ctrl；^@*P（P）*=0.0025对Ctrl**P（P）*=0.009对10^-5M等；^$*P（P）*<0.05与10^-5M ISO。n个= 6

图8
ERK1/2通过FoxO1信号参与C2C12细胞分化和肌纤维类型。一-d日ERK1/2抑制剂PD98059部分消除了连续单剂量ISO抑制实时PCR检测到的MyHC1和MyHC2a表达的作用，并进一步降低了MyHC2b和MyHC2的mRNA水平。^&*P（P）*=0.0000对Ctrl**P（P）*=0.0292对10^-5M ISO；^#*P（P）*=0.0004对Ctrl；n个= 6.e（电子）-克PD98059部分恢复了第页AKT和第页-通过Western blot和谱带强度测定ISO处理的C2C12细胞中的p38MAPK。α-微管蛋白作为内部对照。^&*P（P）*=0.0004对Ctrl**P（P）*=0.0122对10^-5M ISO；n个= 3.小时-我通过Western blot谱带强度分析，ERK1/2抑制剂PD98059可部分降低连续单剂量ISO处理的C2C12细胞中的核FOXO1水平。^&*P（P）*=0.0004相对于Ctrl；^#*P（P）*=0.0124对10^-5M ISO；n个= 3.j个免疫荧光染色检测到ERK1/2抑制剂PD98059部分减少了ISO诱导分化C2C12细胞FOXO1的核移位。红色：FOXO1；绿色：MyHC；蓝色：DAPI标记的细胞核

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持续暴露异丙肾上腺素通过PKA/ERK1/2-FOXO1信号通路抑制成肌细胞分化和融合

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