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.2019年2月13日12时32分。
doi:10.3389/fnmol.2019.00032。 2019年电子采集。

束缚应激致成年大鼠杏仁核高渗透性及血脑屏障损伤

徐光明 1, 李英敏 1, 马春玲（Chunling Ma） 1, 王川（音译） 1, 孙兆玲 1, 沈一文 2, 李柳 三, 李树金 1, 张晓静 1, 宾聪 1
附属公司

束缚应激致成年大鼠杏仁核高渗透性及血脑屏障损伤

徐光明等。 前臼齿神经科学. .

摘要

强烈或长时间暴露于压力下会损坏各种大脑结构，包括杏仁核和海马体，这些结构与情绪认知功能有关。此外，这种恶化与无数神经退行性疾病和精神疾病有关，尤其是通过破坏血脑屏障（BBB）。然而，关于应激对杏仁核BBB的影响和机制，目前尚缺乏深入的研究。本研究探讨束缚应激对成年雄性SD大鼠杏仁核BBB通透性和完整性的影响。采用ELISA法测定血清皮质酮（CORT）和S100B水平。通过测量大鼠杏仁核组织样本中伊文思蓝（EB）渗漏来评估BBB的渗透性。对这些样本进行紧密连接（Claudin-5、Occludin、ZO-1）和粘附连接（VE-cadherin）标记物以及GLUT-1和AQP-4的免疫染色。染色通过共焦显微镜进行评估，并使用Western Blot（WB）技术量化这些蛋白的表达水平。用透射电镜观察脑微血管内皮细胞的超微结构。此外，采用ELISA法测定血清和杏仁核组织中白细胞介素-1β（IL-1β）的含量。束缚应激暴露与血清S100B水平升高和杏仁核组织EB渗漏有关，尤其是在实验的第14天和第21天，这表明BBB的通透性增加。约束应激后，紧密连接、粘附连接和GLUT-1的蛋白质表达显著降低，而AQP-4的蛋白质表达显著增加。荧光强度的变化趋势与这些结果基本一致。在束缚应激后，透射电镜证实杏仁核毛细血管紧密连接处间隙增大，基底膜增厚。此外，束缚应激组血清和杏仁核组织中IL-1β含量增加。这些发现表明，束缚应激介导了BBB通透性的时间依赖性改变，改变了紧密连接和粘附连接蛋白的表达，以及脑微血管内皮细胞的超微结构变化。这与炎症有关。这些改变可能与行为和认知功能障碍以及神经退行性疾病有关。

关键词：AQP-4；GLUT-1；贴壁连接；血脑屏障；渗透；约束应力；紧密连接。

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数字

图1
图1
不同束缚应激时间对大鼠体重、血清CORT水平和焦虑行为的影响。（A）与对照组相比，束缚应激从第3天起显著降低了大鼠的体重增加。（B）与对照组动物相比，应激暴露7天后，血清CORT水平显著升高，21天后达到峰值。（C）不同组之间开臂时间/总时间的EPM比率。（D）开放式武器参赛的EPM比率/不同组别的总参赛人数。（E）各组大鼠EPM运动轨迹。结果以平均值±SD表示，n个=体重和CORT分析为6，n个=9，用于EPM测试分析。数据通过单向方差分析（One-way ANOVA）和Tukey进行分析事后（post-hoc）测试。∗第页< 0.05,∗∗第页<0.01，以及∗∗∗第页与对照组相比<0.001。
图2
图2
束缚应激对大鼠血脑屏障通透性的影响。（A）杏仁核Evans Blue（EB）渗漏的定量分析。与对照组相比，应激暴露14天后，杏仁核内EB外渗显著增加。（B）应激暴露21天后，血清S100B含量也增加。（C、D）western blot分析对照组和应激组杏仁核AQP-4的表达。（E）AQP-4阳性星形胶质细胞的定量评估。（F）对照组和应激组杏仁核AQP-4（红色）和GFAP（绿色）的免疫荧光染色。还显示了AQP-4和GFAP染色的合并图像。结果以平均值±标准差表示，n个=3用于EB和免疫组织化学分析，n个对于S100B和Western印迹分析，＝6。数据通过单向方差分析（One-way ANOVA）和Tukey进行分析事后（post-hoc）测试和非参数Kruskal–Wallis测试，然后是Dunn的多重比较测试。∗第页< 0.05,∗∗第页<0.01，以及∗∗∗第页与对照组相比<0.001。
图3
图3
束缚应激对杏仁核GLUT-1表达的影响。（A）western blot检测GLUT-1的代表性印迹。（B）谷氨酸-1的定量数据。（C）GLUT-1阳性血管的定量评估。（D）对照组和应激组杏仁核内谷氨酸-1（红色）和CD31（绿色）的免疫荧光染色。还显示了i1和CD31染色的合并图像。结果以平均值±SD表示，n个=3用于免疫组织化学分析，n个=6，用于Western Blot分析。数据通过非参数Kruskal–Wallis检验和Dunn多重比较检验进行分析。∗第页<0.05和∗∗第页与对照组相比<0.01。
图4
图4
western blot分析束缚应激对杏仁核TJ蛋白和AJ蛋白表达的影响。（A）ZO-1和VE-cadherin的代表性斑点。（B）ZO-1和VE-cadherin的定量数据。（C）Claudin-5和Occludin的代表性斑点。（D）Claudin-5和Occludin的定量数据。结果以平均值±标准差表示，n个= 6. 数据通过非参数Kruskal–Wallis检验和Dunn多重比较检验进行分析。∗第页< 0.05,∗∗第页<0.01，以及∗∗∗第页与对照组相比<0.001。
图5
图5
束缚应激大鼠杏仁核TJ和AJ免疫荧光强度分析（荧光强度面积比）。（A）对照组和应激组杏仁核内VE-cadherin（红色）和CD31（绿色）的免疫荧光染色。还显示了VE-cadherin和CD31染色的合并图像。（B）VE-cadherin阳性血管的定量评估。（C）对照组和应激组杏仁核ZO-1（红色）和CD31（绿色）免疫荧光染色。还显示了ZO-1和CD31染色的合并图像。（D）ZO-1阳性血管的定量评估。结果以平均值±SD表示，n个=3。数据通过单向方差分析（One-way ANOVA）和Tukey进行分析事后（post-hoc）测试和非参数Kruskal–Wallis测试，然后是Dunn的多重比较测试。∗第页<0.05和∗∗∗第页与对照组相比<0.001。
图6
图6
束缚应激大鼠杏仁核TJ免疫荧光强度分析（荧光强度面积比）。（A）对照组和应激组杏仁核Claudin-5（红色）和CD31（绿色）的免疫荧光染色。还显示了Claudin-5和CD31染色的合并图像。（B）Claudin-5阳性血管的定量评估。（C）免疫荧光染色检测对照组和应激组杏仁核中的闭塞素（红色）和CD31（绿色）。还显示了Occludin和CD31染色的合并图像。（D）阻塞素阳性血管的定量评估。结果以平均值±SD表示，n个= 3. 数据通过非参数Kruskal–Wallis检验和Dunn多重比较检验进行分析。∗第页<0.05和∗∗第页与对照组相比<0.01。
图7
图7
对照组和应激组大鼠杏仁核BBB的透射电镜图。E、 脑微血管内皮细胞；P、 周细胞；IBM，基底膜完整；溶解基膜；TBM，基底膜增厚；TJ，紧密连接；黑色箭头(→) 指示完好的紧密连接；红色箭头(→) 表示不连续或开放紧密连接；黑色五角形(公式图像)指向光滑的管腔膜；红色五角星(公式图像)指向管腔膜突起；星号表示星形胶质细胞水肿。比例尺：500nm，n个= 3.
图8
图8
血清和杏仁核组织中IL-1β含量。（A）与对照组相比，束缚应激大鼠在第3、7、14和21天的血清IL-1β水平显著增加，在第7天达到峰值。（B）束缚应激使杏仁核组织中IL-1β含量增加。结果以平均值±SD表示，n个= 3. 数据通过单向方差分析（One-way ANOVA）和Tukey进行分析事后（post-hoc）测试。∗∗第页<0.01和∗∗∗第页与对照组相比<0.001。
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