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.2019年2月26日；26（9）：2377-2393.e13。
doi:10.1016/j.celrep.2019.01.105。

cGAS的N末端结构域决定了与细胞核中的着丝粒DNA和先天免疫激活的优先结合

马泰奥·金蒂利 1, 泽维尔·拉哈耶 1, 弗朗西丝卡·纳达林 1, Guilherme P F Nader公司 2, 艾米莉亚·普伊格·隆巴迪 3, 索莱恩·埃尔夫 4, 尼卢西·德席尔瓦 1, 德里克·C·鲁库曾（Derek C Rookhuizen） 1, 艾琳娜·祖瓦 1, 克里斯特尔·古多 1, 马修·莫林 1, 奥罗尔·博奇纳基安 1, 塞巴斯蒂安·阿米戈雷纳 1, 马蒂厄·皮尔 2, 丹尼尔·法希内蒂 4, 阿图罗·隆多尼奥·瓦列霍 3, 尼古拉斯·曼内尔 5
附属公司

cGAS的N末端结构域决定了与着丝粒DNA的优先关联和细胞核内的先天免疫激活

马泰奥·金蒂利等。 单元格代表. .

勘误表in

摘要

细胞质DNA激活环鸟苷单磷酸腺苷单磷酸合成酶（cGAS），这是一种先天免疫传感器，在抗菌防御、衰老、自身免疫和癌症中起关键作用。cGAS被认为是一种序列依赖型DNA传感器，由于其分区性，对核DNA的访问受到限制。然而，核膜是一个动态屏障，cGAS存在于原子核中。在这里，我们确定了核cGAS定位和活化的决定因素。我们发现，尽管cGAMP水平比外源DNA转染后低200倍，但核定位cGAS合成cGAMP并诱导树突状细胞的固有免疫激活。使用cGAS-ChIP-seq和GFP-cGAS敲除小鼠，我们发现细胞核cGAS在着丝粒卫星DNA上富集，并通过成像证实，在较小程度上富集在LINE元件上。cGAS的非酶N末端结构域决定了核质定位、着丝粒富集和核定位cGAS激活。这些结果揭示了核cGAS与着丝粒的优先功能关联。

关键词：IRF3；线路；刺痛；cGAMP；cGAS；着丝粒；树突状细胞；干扰素；核膜；卫星DNA。

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数字

无
图形摘要
图1
图1
核膜开放导致cGAS存在于细胞核中（a）量化有丝分裂后人类单核细胞衍生树突状细胞（DC）细胞核（N）或细胞质（C）中的平均内源性cGAS强度（每个供体N>60个细胞，3个独立供体来自2个独立实验；红线表示平均值，黑线表示SD，单因素方差分析，采用事后Tukey检验；∗∗∗∗p<0.0001）。（B） 顶部：内源性cGAS（红色）和DAPI（蓝色）的免疫荧光染色，cGAS染色和（底部）沿着cGAS（红色）和DAPI（蓝色）的黄线测量的像素强度的重叠图。DAPI参考图S1B。比例尺，10μm。（C） 有丝分裂后人类DC的核质分馏和内源性cGAS（顶部）、微管蛋白（中部）和层粘连蛋白B1（底部）的免疫印迹。C、 胞质部分；N、 核分数。4名捐赠者中的一名捐赠人代表。其他捐赠者见图S1C。（D） 两种野生型小鼠骨髓来源DC的核质分馏(重量)或两次cGAS击倒(Cgas公司−/−)小鼠和免疫印迹检测内源性cGAS（顶部）、微管蛋白（中部）和层粘连蛋白B1（底部）。C、 胞质部分；N、 核分数（代表N=3只独立小鼠）。（E） 循环HeLa细胞稳定表达组蛋白2B（H2B）-mCherry（红色）和GFP-cGAS（绿色）在核膜破裂前（0分钟）、破裂后（56–57分钟）和破裂后（80分钟）的序列图像。比例尺，10μm。（F） 细胞内平均GFP-cGAS强度的核质比，如（E）所示（n=59个来自2个独立实验的细胞；红线表示平均值，误差线表示SDs）。（G） 一个代表性HeLa细胞的序列图像，如（E）中的有丝分裂前细胞液中的GFP-cGAS。比例尺，10μm。另请参见图S1。
图2
图2
核定位cGAS激活DC的先天免疫反应（A）在反向HLA-DRα启动子控制下GFP插入慢载体的示意图。箭头表示转染293FT细胞中LTR和转导DC中反向HLA-DRα启动子的转录方向。（B） 共聚焦显微镜观察在倒置HLA-DRα启动子控制下用GFP（顶部）、GFP-cGAS（中部）或GFP-NLS-cGAS的慢载体转导的DC。GFP（绿色）、DAPI（蓝色）。来自n=2个捐赠者中的1个捐赠者的一个代表性字段。比例尺，10μm。（C） 在有或无Vpx的情况下，用编码GFP、GFP-cGAS或GFP-NLS-cGAS的慢载体转导后，DC中GFP和CD86的表达。在4个独立实验中代表n=9名捐赠者。（D） CD86在转导的DC中的表达如（C）所示；n=4个独立实验的9名供体。单向方差分析与事后Tukey检验。（E） SFFV启动子控制下GFP插入慢载体的示意图，如（A）所示。（F） 在存在或不存在Vpx的情况下，在pTRIP SFFV中用GFP-NLS（对照[CTR]）或GFP-NLS cGAS慢载体转导后，DC中GFP和CD86的表达。在2个独立实验中代表n=4名捐赠者。（G） GFP和SIGLEC1在DC中的表达如（F）中稳定转导。在2个独立实验中代表n=4名捐赠者。（H） CD86在转导的DC中的表达如（F）所示；在2个独立实验中，n＝4个供体。单向方差分析与事后Tukey检验。（一） 在有或无Vpx的情况下，如（F）所示转导的DC中SIGLEC1的表达；n=2个独立实验的4个供体。单向方差分析与事后Tukey检验。（J） GFP内pTRIP-SFFV中GFP-NLS或GFP-NLS-cGAS慢载体的剂量滴定中CD86的表达+（绿色）和GFP−（黑色）DC人群。实线表示平均值，浅色极限表示SEM；n=2个独立实验中的4个供体。单向方差分析与事后Tukey检验。（K） 如（J）所示转导的细胞的SIGLEC1表达。（五十） 的表达式MX1型,CXCL10系列,国际单项体育联合会1、和办公自动化系统1相对于ACTB公司，在用GFP-NLS或GFP-NLS-cGAS慢载体转导的DC中；n=6名供体来自2个独立实验。对日志转换数据进行单因素方差分析和事后Sidak检验。∗p<0.05，∗∗p<0.01，∗∗∗p<0.001，∗∗∗∗p<0.0001，ns，无显著性。另请参见图S2。
图3
图3
cGAS的核定位导致循环293FT细胞中DAPI（蓝色）和cGAS（红色）的免疫荧光染色有限cGAMP产生（A），该细胞稳定地转染pTRIP-CMV中的对照（空载体[EV]）（顶部）、cGAS或NLS-cGAS慢载体。比例尺，10μm。（B） 在（A）中描述的细胞提取物中通过cGAMP生物测定进行cGAMP定量。n=3个独立实验的平均值和SEM。稀释倍数为3倍。（C） 用1μg/mL HT-DNA刺激过夜的（A）中所述提取物的cGAMP定量。cGAMP的定量如（B）所示。n=3个独立实验的平均值和SEM。稀释倍数为3倍。（D） 基于有效浓度50（EC）的cGAMP相对于cGAMP合成标准物的定量50)cGAMP生物测定曲线。n=3个独立实验的平均值和SEM。单样本t试验。（E） 用cGAMP ELISA测定细胞内cGAMP浓度，如（A）所示。n=3个独立实验的平均值和SEM。灰色虚线表示检测下限；条形图显示几何平均值。对日志转换数据进行单向方差分析和事后Tukey检验。（F） GFP-NLS转导的DC的核（N）和细胞质（C）部分中GFP-FLAG-cGAS、GFP-NLS-FLAG-cGA、微管蛋白、钙连蛋白和层粘连蛋白A/C的表达，或SFFV启动子的相应cGAS慢载体（代表N=5个独立供体）。GFP-FLAG-cGAS样品的减少材料与激活诱导的细胞死亡相关。（G） 用cGAMP-ELISA测定DCs细胞质和核部分的cGAMP浓度，如（F）所示。灰色虚线表示检测下限。n=5名独立捐赠者的平均数和SEM。条形图显示几何平均值。对日志转换数据进行单向方差分析和事后Tukey检验。∗p<0.05，∗∗p<0.001，ns，不显著。另请参见图S3。
图4
图4
密闭诱导的核膜破裂不会激活细胞限制器的cGAS-STING-IRF3轴（A）方案。（B） 用mCherry-cGAS E225A/D227A、BFP-2A-STING和GFP-IRF3（HeLa STING）转导的HeLa细胞和HeLa电池中cGAS、STING和vinculin的免疫印迹。（C） 用4μg/mL HT-DNA转染HeLa STING的序列图像。转染时间为0分钟。mCherry-cGAS E225A/D227A与转染DNA的结合在时间=100 min时显示，并随着时间的推移而累积。GFP-IRF3病灶和胞质小泡的形成时间为150分钟。GFP-IRF3易位在165分钟达到峰值。一个代表性单元用于n=2个独立实验。比例尺，10μm。（D） 限制、限制和转染HT-DNA或仅转染HT-DNA后显示GFP-IRF3核转位的细胞定量。表达内源性cGAS的周期性HeLa细胞被稳定转导，如（B）单向方差分析和事后Tukey检验；ns，不显著；∗∗∗∗p<0.0001；数据来自3个独立实验。（E） HeLa细胞在禁闭后3μm（时间=0 min；左侧）和禁闭后6 h，45 min（时间=345 min；右侧）立即稳定转导的序列图像如（B）所示。箭头表示NE破裂的细胞，如细胞核中明亮的mCherry-cGAS E225A/D227A病灶所示。一个具有代表性的领域。比例尺，10μm。（F） 稳定转导的HeLa细胞的序列图像，如（B）所示，在3μm（时间=0分钟；左）和6小时后，45分钟（时间=345分钟；右）进行3μm限制，并在限制后立即用4μg/mL HT-DNA转染。箭头表示细胞质中有mCherry-cGAS斑点的细胞，随后细胞核中GFP-IRF3易位。一个具有代表性的领域。比例尺，10μm。（G） 转染4μG/mL HT-DNA后（时间=0分钟）和345分钟后的HeLa STING细胞序列图像。对于（D）中的定量，仅对细胞质中具有明亮GFP-IRF3焦点的细胞进行定量，以排除GFP-IRF3由于cGAMP通过间隙连接转移而易位的细胞。比例尺，10μm。（H） GFP-NLS、GFP-FLAG-cGAS E225A/D227A的表达(∗)，GFP-NLS-FLAG-cGAS E225A/D227A(∗∗)DC中的内源性cGAS（ˆ）和肌动蛋白通过相应的慢载体（代表2个独立供体）转导。（一） BFP报告者HIV-1和HIV-2病毒感染48小时后，以及HT-DNA或cGAMP转染24小时后（n=2个独立供体），DC中BFP、CD86和SIGLEC1的表达如（H）。
图5
图5
核cGAS与着丝粒卫星DNA相关（A）表达GFP-NLS-cGAS的DC细胞核的3D投影（绿色）。（B） GFP-NLS-cGAS在DC中稳定转导的ChIP-seq实验方案。（C） GFP-NLS-cGAS上ChIP-seq过滤峰的注释。峰<10的元素变灰（1个供体代表3个独立供体）。（D） 圆形图显示GFP-NLS-cGAS和CENP-A峰的分布以及CENP-B盒（一致序列）在hg38基因组上的定位。cGAS轨迹表示来自3个供体的选定滤波峰（162个区域）的折叠变化（芯片输入）。CENP-A轨迹表示在尺寸为10的窗口上计算的CENP-A交叉口峰值（5977个区域）的密度7跨越基因组。CENP-B盒轨迹在x轴上报告该区域的基因组位置（CENP-B-盒共识序列的出现），在y轴上报告区域到其两个相邻区域的最小距离（log10转换）。（E） GFP-NLS-cGAS峰与来自GM12878细胞的公共H3K27Ac峰、来自外周血单个核细胞（PBMC）的H3K9me3峰以及来自HeLa S3细胞的内源性CENP-A峰的关联。使用供者1的过滤GFP-NLS-cGAS峰（404峰，1545600 bp）（代表3个独立供者）。（F） GFP-NLS-cGAS ChIP-seq的cGAS特定峰在GFP-NLS ChIP-seq过滤峰上的序列富集（两个独立供体峰的交集）。评估了三个基序：卫星III DNA基序重复，[GGAAT]n>3；CENP-B盒共识序列，NTTCGNNNNANNCGGN；和端粒重复序列n>1.（G）重复序列上的cGAS特异性读数富集。如果任何样本中的每百万读取计数（cpm）≥2，则认为重复发生。根据GFP-NLS上的ChIP读取富集，将重复数据分为n=10个箱子。对于每个重复类R（右），第一个我箱子，对应顶部（100/我)%等级，显示为从白色到黑色的渐变。只有基因组中至少有10个读取出现且通过cpm截止值的重复类才会被考虑，并通过减少前50%中的出现次数从左到右进行排序（1个供体代表n=2个独立供体）。（H） 用pTRIP SFFV中的GFP-NLS慢载体稳定转导的DC，并对CENP-B进行染色。（左）CENP-B的Z投影（白色）与核掩膜（黄色）以及（右）CENP-B（红色）和GFP-NLS（绿色）的正交投影（单共聚焦平面）。比例尺，2μm。（一） CENP-B病灶或细胞核随机区域中GFP强度的量化，归一化为平均核GFP强度，如（H）中转导的细胞；7个独立细胞中n≥140个病灶或随机区域。每个点代表一个CENP-B焦点。表示平均值和SD。在2个独立实验中，一个供者代表n=4个供者。学生的t测试。（J） 在pTRIP-SFFV中用GFP-NLS-cGAS慢载体稳定转导DC，并对CENP-B进行染色，如（H）所示。比例尺，2μm。（K） CENP-B病灶或核内随机区域GFP-NLS-cGAS强度的量化，如（I）所示。（五十） CD86和IFN-λ1由转染合成DNA重复序列的DC表达，该DNA重复序列编码AATGG卫星基序、相应的洗牌序列或指示DNA浓度下的HT-DNA（实线、平均值；虚线、SEM；独立供体：CD86的n=9，IFN-λ的n=7；IFN-λ1）对数转换数据的双向方差分析和Tukey检验。∗∗p<0.01，∗∗∗p<0.001，∗∗∗∗p<0.0001。另请参见图S4。
图6
图6
cGAS N末端结构域确定α-卫星的关联、胞质保留和细胞核中的激活（A）（左）cGAS缺失的示意图和（右）用人全长催化非活性cGAS、cGAS的N末端部分（cGAS 1–212）或C末端部分（C GAS 161–522）转导的DC的共焦显微镜与pTRIP-SFFV中的GFP融合。GFP通道以黑白显示。在2个独立实验中，一个具有代表性的供体n=4个供体。比例尺，10μm。（B） （左）cGAS缺失示意图和（右）共焦显微镜下用pTRIP-SFFV中人类全长催化非活性cGAS或cGAS 1–160转导的DC。GFP通道以黑白显示。在2个独立实验中，一个具有代表性的供体n=4个供体。比例尺，10μm。（C） 在存在或不存在Vpx的情况下，用GFP-NLS、GFP-NLS-cGAS、GFP-cGAS 161-522或GFP-NLS-cGAS 61-522慢载体在pTRIP-SFFV中转导后，DC中GFP、CD86和SIGLEC1的表达。在3个独立实验中，一个具有代表性的供体n=6个供体。（D） CD86和SIGLEC1在DC中的表达如（D）所示；在3个独立实验中，n＝6个供体。单向方差分析与事后Tukey检验。（E） 共聚焦显微镜Cgas公司−/−pTRIP-SFFV慢载体中转导GFP-NLS、GFP-cGAS、GFP-NLS-cGAS，GFP-cGA 1–160或GFP-cGIS 161–522的小鼠骨髓来源DC。GFP通道以黑白显示。一只n=2的代表性老鼠。比例尺，10μm。（F） 的表达式Ifit1号机组在里面Cgas公司−/−pTRIP-SFFV慢载体中转导GFP、GFP-NLS、GFP-cGAS、GFP-NLS-cGAS，GFP-cGAS 1–160或GFP-cGA 161–522的小鼠骨髓来源DC，未经处理或用逆转录酶抑制剂（AZT+NVP）处理或用cGAMP转染；n=4只小鼠，来自2个独立实验。条形表示几何平均数。使用Sidak检验对日志转换数据进行单向方差分析。（G） 在pTRIP-SFFV中，用GFP-NLS或指示的GFP-cGAS慢载体转导的DC中，核内CENP-B病灶中GFP强度的量化，归一化为平均核GFP强度；每个结构体n≥140个病灶在每个结构体7或8个独立细胞中定量。每个点代表一个CENP-B焦点。表示平均值和标准偏差。在2个独立实验中，一个具有代表性的供体n=4个供体。单向方差分析与事后Tukey检验。∗∗∗p<0.001，∗∗∗∗p<0.0001，ns，无显著性。另请参见图S5。
图7
图7
内源性cGAS与着丝粒相关（A）循环U2OS细胞中期扩散的代表性免疫荧光图像，显示内源性cGA在内着丝粒富集。CENP-A标记着丝粒位置。黄色箭头指向内部着丝粒处的cGAS定位。比例尺，5μm。（B） 左上：着丝粒放大，如（a）所示，显示两个CENP-a病灶之间cGAS富集。右上角：分别在内着丝粒和内着丝点和着丝粒的预期CENP-A和ACA定位示意图。底部：沿着着丝粒的ACA、CENP-A和cGAS荧光强度扫描线的归一化平均值。误差条表示1个细胞中36个着丝粒的SEM（代表2个独立实验）。（C） 距离归一化后单个染色体的ACA、CENP-A和cGAS强度的热图，如（B）所示（n=22条染色体，代表2个独立实验）。（D） 所示ISG的基线表达(Ifit1、Ifit2、Oas1a)骨髓来源DC中Cgas公司−/−老鼠或WT室友。条形图表示平均值，误差条形图表示SEM。每个点代表一个单独的鼠标；n=3个实验中每个基因型组合6只小鼠；采用事后Tukey检验的单因素方差分析；∗∗∗∗p<0.0001。（E） GFP-cGAS敲除位点概述。（F） GFP-cGAS小鼠树突状细胞ChIP-seq的实验方案绿色荧光蛋白cGASKI/KI老鼠。（G） ChIP-seq的显著峰值注释Cgas公司KI/KI小鼠DC过度输入。峰值小于10的元素变灰。（H） 小鼠DC内源性GFP-cGAS过度输入的显著峰值（重复1和2的峰值交叉）与人类DC（供体1）过度表达GFP-NLS-cGAS的显著峰值相比的注释。不包括峰值小于10的元素。（一） ChIP-seq读富集重复序列；Cgas公司KI/KI鼠标DC中输入过多。SATMIN，小鼠小卫星DNA；GSAT_MM，小鼠γ-卫星重复序列；IMPB_01，小鼠6号染色体重复区共识；SQR1_MM，SQR2_MM，SQR4_MM，小鼠简单重复DNA（sqr家族）；ZP3AR，来自Muridae的卫星。（J） cGAS在间期细胞质中表达的工作模式，然后由于有丝分裂定位到细胞核。
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