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比较研究
.2019年6月；137(6):919-937.
doi:10.1007/s00401-019-01979-0。 Epub 2019年2月27日。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-4介导灵长类大脑中TDP-43的细胞质积累

彭寅 1 2, 郭湘玉 1, 杨伟力 1 2, 森严（Sen Yan） 1, 苏阳 2, Ting Zhao（赵婷） 2, 孙强 三, 刘云波 4, 李世华 5, 李晓江 6 7
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比较研究

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-4介导灵长类大脑中TDP-43的细胞质积累

彭寅等。 神经病理学学报. 2019年6月.

摘要

细胞核TAR DNA-结合蛋白43（TDP-43）的细胞质积聚是肌萎缩侧索硬化、额颞叶变性和其他神经系统疾病的病理特征。然而，大多数转基因TDP-43啮齿动物模型显示TDP-43在大脑中的核分布占主导地位。通过在恒河猴和小鼠的大脑中表达突变TDP-43（M337V），我们验证了突变TDP-44分布在猴脑的细胞质中，并且大多数突变TDP-53仍存在于小鼠大脑的细胞核中。灵长类特异性caspase-4，而非小鼠同源caspase-11，可以去除含有NLS的N末端结构域，并生成碎片化TDP-43，积聚在细胞质中。此外，猴脑中胱天蛋白酶-4表达的增加促进了内源性TDP-43的细胞质积累，而抑制胱天蛋白酶-4减少了内源性TDP-43在培养的人类神经细胞中的细胞质分布。我们的研究结果表明，灵长类特异性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-4介导的TDP-43裂解是导致其在灵长类大脑中细胞质定位错误的原因，并可能成为潜在的治疗靶点。

关键词：聚合；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-4；神经变性；非人灵长类；TDP-43。

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数字

图1
图1
注射AAV-TDP-43的猴子和小鼠的表型。一腺相关病毒载体表达突变型TDP-43（M337V），受人类泛素启动子控制。b在黑质右侧注射AAV-GFP（对照）或AAV-TDP-43的代表性猴子的照片。注射AAV-TDP-43的猴子显示了瘫痪的左上肢（箭头所示），其运动受对侧右侧黑质的控制。c（c）注射AAV-TDP-43的猴子表现出左上肢抓取力下降。视频记录了四只注射AAV-TDP-43和两只注射AAV-GFP的猴子用手（左上肢和右上肢）抓住天花板围栏和测试棒的情况。每只猴子每次都被录像30分钟。使用六次记录的抓取次数进行统计分析(n个 = 同一检查日平均6次 ± 扫描电镜*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01).d日注射AAV-TDP-43的猴子左上肢握力下降。猴子进来了(c（c）)通过拉动弹簧手测力计测量他们左右手的握力。每只猴子在同一检查日接受六次测试，并记录握力计上的力（kg）数字分数进行分析(n个 = 平均6倍 ± 扫描电镜*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001).e（电子）生存图显示，在黑质中表达TDP-43不会影响猴子的生存率。给9-15岁的猴子注射AAV-GFP或AAV-TDP-43(n个 = 每组6只猴子）。（f）表达AAV-TDP-43（10）的代表性小鼠照片8vg）位于黑质右侧，显示驼背表型和有缺陷的平衡梁运动（箭头）。AAV-GFP（108注射vg）的小鼠作为对照。克力量测试表明，在小鼠黑质注射AAV-TDP-43可导致运动功能受损，后肢握力测试表明。AAV-GFP注射作为对照。小鼠8–12个月大，注射AAV-TDP-43或AAV-GFP(n个 = 平均12只小鼠 ± SEM，每组**P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001)
图2
图2
突变TDP-43（M337V）在猴和鼠脑中的亚细胞差异定位和降解。一猴黑质的TDP-43免疫染色显示AAV-TDP-43注射后突变TDP-43（红色，上面板）的细胞质定位。神经元细胞核用DAPI（蓝色）标记。在小鼠大脑（下面板）中，突变TDP-43主要定位于注射的黑质细胞核（箭头所示）。右侧面板显示了含有核（Nucl）或细胞质（Cyto）TDP-43的细胞在DAPI染色细胞总数中的相对数量（平均值 ± 扫描电镜***P（P） < 0.001). 比例尺20μm。bAAV-TDP-43注射猴和小鼠脑黑质组织的Western blotting分析。用C-末端TDP-43抗体进行探测发现，猴组织中富含C-末端的TDP-43片段（35-和25-kD），但在注射的小鼠大脑中很少见到。c（c）Western blotting检测到的截短TDP-43（35-和25-kD）与全长TDP-43的比率(b). 这些比率是从三个独立的Western印迹实验中获得的(***P（P） < 0.001).d日免疫印迹分析猴和小鼠注射AAV-GFP或AAV-TDP-43黑质中神经元（NeuN）和星形胶质细胞（GFAP）蛋白的表达。用NeuN、GFAP和GAPDH抗体探测蛋白质印迹。e（电子）蛋白质印迹中NeuN/GAPDH和GFAP/GAPDH的比率(d日). 数据来自对两个AAV-GFP-和两个注射AAV-TDP-43的小鼠黑质组织的三个独立的Western blotting分析；或两个AAV-GFP-和四个AAV-TDP-43注射猴黑质组织(**P（P） < 0.01***P（P） < 0.001)
图3
图3
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-4在体外选择性裂解TDP-43。一用于表达GST-TDP-43融合蛋白的质粒DNA结构。猴脑中TDP-43（35-kD和25-kD）的裂解可以分别在42-kD与32-kD处生成截断的GST-TDP-43融合蛋白。完整的GST-TDP-43大小约为68-kD。RRM：RNA识别基序。b体外半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶检测TDP-43。将Sepharose珠中含有突变TDP-43（M337V）的GST融合蛋白与等量的小鼠或猴脑裂解物孵育过夜。然后离心这些珠子，并用抗GST蛋白免疫印迹法进行分析。c（c）与猴子或小鼠的脑匀浆裂解物孵育的GST-TDP-43的蛋白质印迹分析。将珠离心并用抗GST分析。当与小鼠脑裂解物孵育时，这些片段的表达水平最低。碎片TDP-43与完整全长GST-TDP-43（68-kD）的比值是从三个独立实验中获得的，如右图所示。d日GST-TDP-43（M337V）在与小鼠或猴脑的不同亚细胞组分（总匀浆、核、胞浆和线粒体）孵育后裂解的Western blotting分析。与其他组分相比，细胞溶质组分产生更多片段化TDP-43（42-kD和32-kD）。右侧面板显示了42-kD或32-kD波段与完整GST-TDP-43（68-kD）的比值。数据是平均值 ± 扫描电镜(n个 = 3, ***P（P） < 0.001）。e、 （f）GST-突变体TDP-43（M337V）裂解的Western blotting分析表明，泛酶抑制剂ZVAD-fmk的孵育(e（电子）)或caspase-4抑制剂LEVD-fmk(（f）)能够阻止猴脑裂解物对TDP-43的裂解。输入通道为等分GST-TDP-43（68-kD），无需与猴子或小鼠组织裂解物孵育
图4
图4
Caspase-4在猴脑中特异表达，其活性可被突变的TDP-43上调。一野生型猴和小鼠大脑和外周组织中caspase-4（CASP4）表达的Western blotting分析。b用一种特殊的Caspase-4底物Ac-YVAD-AFC荧光法测定了注射AAV-GFP或AAV-TDP-43（M337V）的猴脑中的Caspase-4（CASP4）活性。数据是平均值 ± 扫描电镜(n个 = 3只AAV-GFP猴子，以及n个 = 3只AAV-TDP-43猴子**P（P） < 0.01).c（c）免疫印迹法分析注射AAV-GFP或AAV-TDP-43（M337V）的猴脑中caspase-4的表达。与注射AAV-GFP的猴脑相比，注射AAV-TDP-43的猴脑中caspase-4的激活形式（箭头）更为丰富。右侧面板显示了三个独立实验的定量数据（活化的胱天蛋白酶-4与β-肌动蛋白的比率）(**P（P） < 0.01).d日GST-TDP-43（M337V）与注射AAV-GFP或AAV-TDP-43的猴脑裂解物孵育后的蛋白质印迹分析。在注射AAV-TDP-43的脑裂解物中发现更多的裂解GST-TDP-43片段，caspase-4抑制剂LEVD-fmk可以完全阻断裂解。切割的TDP-43片段与完整形式（68 kD）之比的定量数据显示在三个独立实验的右侧面板中(**P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001)
图5
图5
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-4在ALS患者大脑中增加，并介导TDP-43的细胞质定位。a、 b条五名ALS患者和五名非ALS对照者caspase-4（CASP4）和C末端TDP-43表达的Western blotting分析(一). 活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-4条带（箭头所示）与GAPDH或裂解的TDP-43与全长TDP-43的比率如印迹右侧所示(b). *P（P） < 0.05, ***P（P） < 0.001.c（c）与ALS患者或非ALS对照个体的大脑皮层裂解物孵育后GST-TDP-43（M337V）裂解的Western blotting分析。注意，ALS患者脑裂解物中的TDP-43片段（32-和42-kD）比对照脑裂解物丰富得多**P（P） < 0.01.d、 e（电子）用pEGFP-TDP-43（M337V）和DesRed-human caspase-4（CASP4）或DesRed-Mouse-caspase-11（CASP11）转染小鼠N2A细胞。绿色荧光TDP-43显示了与DesRed-human-caspase-4联合转染的细胞中的细胞质和细胞核定位，但没有显示DesRed-mouse-caspase-11。细胞核用DAPI染色(d日). 比例尺：20μm。共转染caspase-4（CASP4）或caspase-11（CASP11）时，转染N2A细胞的定量显示细胞质（细胞）或核TDP43超过转染细胞总数。随机六个场中40×透镜下120个阳性细胞计数(e（电子）) (n个 = 每组3个独立实验**P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001).（f）转染N2A细胞的Western blotting分析也表明，caspase-4而非caspase-11的共同表达显著增加了截短TDP-43（35-和25-kD）片段的生成，这也通过blots上截短的TDP-43与全长TDP-43比率的量化得到了证实（右侧面板）。n个 = 3个实验***P（P） < 0.001
图6
图6
突变TDP-43的半胱氨酸蛋白酶-4裂解导致TDP-43片段在小鼠大脑中的细胞质定位。一在人类泛素启动子控制下表达人类caspase-4的AAV9病毒载体示意图。b被AAV感染的小鼠N2A细胞中caspase-4（CASP4）的表达。通过Western blotting检测Caspase-4。c（c）向小鼠脑黑质注射AAV-TDP-43和AAV-caspase-4。用caspase-4和C末端TDP-43抗体进行双重免疫荧光染色，显示TDP-43（绿色）在也表达人caspase-3（红色）的细胞（箭头）中的细胞质定位。在仅表达AAV-TDP-43的细胞中，TDP-43定位于DAPI染色的细胞核中。比例尺：40μm。d、 e（电子）使用C-末端-TDP-43抗体（上面板）对联合注射AAV-caspase-4和AAV-TDP-43（M337V）的小鼠黑质组织进行Western blotting分析。样品也用抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-4（下面板）进行了探测。单独注射AAV-GFP或AAV-TDP-43（M337V）作为对照(d日). 注意，人类caspase-4的共同表达导致产生35和25 kD的C末端TDP-43片段，这得到了切割TDP-43碎片与完整形式（43 kD）比率的定量数据的支持(e（电子）) (n个 = 6, ***P（P） < 0.001)
图7
图7
敲低caspase-4表达降低了内源性TDP-43在人SH-SY5Y细胞中的细胞质分布。一用胱天蛋白酶-4（CASP4）siRNA或对照扰乱siRNA转染的人SH-SY5Y细胞的免疫荧光染色。绿色荧光标记的内源性TDP-43仅在细胞未经膜霉素处理时显示细胞核定位。衣霉素处理增加了内源性TDP-43的细胞质分布，这种增加可以通过siRNA-casase-4而不是siRNA-对照减弱。细胞核用DAPI染色。比例尺：40μm。b用caspase-4 siRNA或干扰对照siRNA转染人SH-SY5Y细胞48 h，然后用衣霉素（1μg/ml）处理12 h。用抗C末端TDP-43抗体检测印迹。注意，衣霉素治疗增加了前caspase-4产生的活化caspase-4的水平，siRNA-caspase-3可以抑制这种增加。c（c）Western blotting定量分析切割内源性TDP-43的相对水平（与全长TDP-43之比）(b). 数据来自三个独立的实验。(***P（P） < 0.001).d日转染siRNA-casase-4或其干扰siRNA对照，然后用1μg/ml衣霉素处理的SH-SY5Y细胞的活性测定。值（平均值 ± 细胞活力的SEM）表示为未经衣霉素/siRNA处理的对照细胞的%，并从三个独立的实验中获得。(**P（P） < 0.01***P（P） < 0.001)
图8
图8
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-4的裂解导致猴子内源性TDP-43在体内的细胞质分布。猴脑前额叶皮层注射AAV-GFP（对照）(一)或AAV-caspase-4(b). C末端TDP-43和GFP或caspase-4抗体的双重免疫荧光染色显示内源性TDP-43（红色）在表达GFP（绿色）的细胞（箭头）中的核定位。然而，在表达AAV-caspase-4的细胞中，内源性TDP-43定位于细胞质中，而不表达caspase-4。DAPI染色的细胞核（星形）。比例尺：40μm。c（c）定量分析表达核（Nucl-）或细胞质（Cyto-）TDP-43的细胞相对于含TDP-43细胞总数的相对数量。数据（含核或细胞质TDP-43的细胞百分比）为平均值 ± 扫描电镜（SEM），通过对三只猴子每个样品注射区域的6张随机图像（40×透镜）中的80个细胞进行计数获得(**P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001)
图9
图9
啮齿动物和灵长类大脑中TDP-43亚细胞差异积累的拟议模型。半胱天冬酶-4在灵长类大脑中的独特表达导致全长TDP-43断裂，并产生其C末端片段，这些片段可积聚在细胞质中。虽然这种细胞质重新分布可以降低细胞核TDP-43的水平，从而导致功能丧失，但TDP-43 C末端区域的突变可能会促进C末端TDP-43在细胞质中的错误折叠和积累，从而引发毒性的功能获得
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