Grafted Human iPSC-Derived Neural Progenitor Cells Express Integrins and Extend Long-Distance Axons Within the Developing Corticospinal Tract

doi:10.3389/fncel.2019.00026

.2019年2月12日13时26分。

doi:10.3389/fncel.2019.00026。 2019年eCollection。

移植的人iPSC-Derived神经前体细胞表达整合素并在发育中的皮质脊髓束内延伸长距离轴

林赛·H·福布斯¹, 梅丽莎·安德鲁斯^1 2

附属公司

PMID： 30809126
预防性维修识别码： PMC6380224型
内政部： 10.3389/fncel.2019.00026

移植的人iPSC-Derived神经前体细胞表达整合素并在发育中的皮质脊髓束内延伸长距离轴

林赛·H·福布斯等。前细胞神经科学. 2019.

.2019年2月12日13时26分。

doi:10.3389/fncel.2019.00026。 2019年eCollection。

作者

林赛·H·福布斯¹, 梅丽莎·安德鲁斯^1 2

附属公司

¹英国圣安德鲁斯大学医学院。
²英国南安普顿大学生物科学系。

PMID： 30809126
预防性维修识别码： PMC6380224型
内政部： 10.3389/fncel.2019.00026

摘要

脊髓损伤（SCI）后，成人运动轴突（如皮质脊髓束（CST）中的轴突）的再生受到严重限制。除了抑制性损伤环境外，成熟中枢神经系统（CNS）中的大多数神经元亚型本质上是不可修复的。随着年龄的增长，神经元中促生长蛋白的表达，如整合素，会下降。整合素受体允许细胞外基质（ECM）和细胞骨架之间的通信，它们在轴突中的表达促进了整个ECM的生长和引导。α9β1整合素异二聚体与tenascin-C（TN-C）结合，这是一种在发育和损伤后表达的ECM糖蛋白。然而，在成熟的CST中，α9整合素亚基的表达下调，增加了轴突再生的固有能力。我们以前的工作表明，α9整合素亚基在成熟CST或红核脊髓束（RST）的轴突内不被转运。因此，我们利用人诱导多能干细胞（iPSC）衍生的神经前体细胞（NPC）来增加发育中大鼠CST内α9整合素的表达。我们证明，人类NPC（hNPC）表达α9和β1整合素亚基的内源性水平以及皮质神经元标记物，如鸡卵清蛋白上游启动子转录因子（COUP-TF）相互作用蛋白2（Ctip2）和T盒脑1（Tbr1）。此外，慢病毒介导的α9整合素在hNPC中的过度表达导致TN-C存在时突起生长增加在体外在移植到新生大鼠的感觉运动皮层后，野生型（WT）和表达α9的hNPCs都沿着内源性CST延伸，并在移植后的8周内保持α9在整个轴突区的表达。这些数据突显了移植的人iPSCs的生长潜力，这可能是神经系统损伤后再生治疗的未来目标。

关键词：诱导多能干细胞；神经祖细胞；感觉运动皮层；移植；α9整合素。

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数字

图1
人诱导多能干细胞（iPSC）衍生神经前体细胞（NPC）中整合素、促生长蛋白和深层皮质神经元标记物的内源性表达。内源性α9（A）和β1（B）用western blotting（WB）证实了野生型（WT）人NPC（hNPC）中整合素亚基的表达，在约115kDa（α9整合素）或120kDa的水平上观察到微弱的条带。这与视网膜色素上皮（RPE）细胞裂解物一起分析，作为两种整合素亚基的阳性对照。斑点也用β-肌动蛋白（约42 kDa）染色，以确认蛋白质负载量相等。免疫细胞化学（ICC）分析进一步证实内源性α9水平较低**（C、D）**和β1（E、F）hNPC内整合素亚单位的表达。此外，ICC分析显示hNPC表达tenascin-C（TN-C），如点状点（白色箭头，**G、 H（H）**)细胞核周围（用DAPI识别）。hNPC也表达一些促生长蛋白，包括祖细胞标记物双皮质素（DCX），在细胞体和神经突起中都可以观察到（白色箭头，我)，其与βIII微管蛋白共标记（白色箭头，J型). 神经营养因子脑源性神经营养因子（BDNF）的表达**K、 L（左）**)其受体Trk B（白色箭头**M、 N个**). hNPC培养物主要含有βIII-管蛋白阳性细胞（**O（运行）**)然而，一些胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性细胞（白色箭头**P（P）**)也检测到。培养21天后未检测到髓鞘碱性蛋白（MBP）阳性细胞**（问）**深层皮质神经元标记物T盒脑1（Tbr1；白色箭头，**R–T型**)和鸡卵清蛋白上游启动子转录因子（COUP-TF）相互作用蛋白2（Ctip2；白色箭头，**U–W型**)在DAPI染色的hNPC细胞核内发现ICC。细胞与βIII-管蛋白和DAPI共同染色。比例尺输入(**C–N、T、W**)=20μm；(**O–S、U、V**)=100微米。

图2
使用慢病毒过度表达α9-增强的黄色荧光蛋白（α9-eYFP）和法尼酰化的绿色荧光蛋白（fGFP）。使用带有抗GFP抗体的ICC检测α9-eYFP的过度表达（A类)在hNPC投影内检测到（白色箭头B类)并与βIII-管蛋白联合标记。在细胞体和整个投影长度内观察到整合素的表达。fGFP表达在hNPC转导后通过使用GFP和βIII-管蛋白抗体检测到的LV-fGFP进行鉴定（白色箭头位于**C、 D类**). 在未转导的WT-hNPC中未观察到GFP表达**（E、F）**。使用WB确认过度表达**（G）**使用抗GFP抗体，在第2车道产生约140 kDa的条带（LV-α9-eYFP hNPC裂解物），在第3车道产生约30 kDa条带（LV-fGFP hNPC分解物）。在含有WT-hNPC裂解物的1号通道中未观察到GFP带。β-肌动蛋白免疫印迹证实蛋白质载量相等（约42 kDa）。在高倍镜下，观察到α9-eYFP以点状排列（白色箭头位于**H–J型**). 比例尺输入**（A–F）**=50微米，**（H）**=15微米，**（一）**=5μm和**（J）**=2.5μm。

图3
在iPSC-derived hNPCs中增加α9整合素的表达可以促进神经突起的生长。在用LV-α9-eYFP或LV-fGFP转导hNPC后，细胞在10μg/mL鸡TN-C上生长(n个= 4;**A、 -C、M、Q**)或1μg/mL(n个=3），5μg/mL(n个=3）或10μg/mL(n个=3）人TN-C（D–L，N–Q）细胞在培养72小时后固定，并用ICC分析，使用抗βIII-管蛋白标记神经突（白色箭头**A–L**)使用NeuronJ进行测量。结果采用单因素方差分析（ANOVA）进行分析，并表示为平均值±SEM**P（P）*< 0.05, ****P（P）*< 0.001. 比例尺输入**（A–L）**=200微米。

图4
注射到感觉运动皮层的iPSC衍生的hNPCs沿着固有锥体束延伸轴突，投射到脑干。用抗人核抗原（抗HuNu）对组织进行染色，该抗原在注射部位检测到细胞团，该细胞团要么分散（白色箭头A类)或更紧凑（中的白色箭头B类). 使用抗人神经细胞黏附分子（anti-hNCAM）鉴定这些投射物，并观察到这些投射物通过内锥体束区域从丸中发出。其中包括内囊**（C–E）**大脑脚，**（F，G）**和金字塔的区域**（H、J、J*）**为了证实移植后2周在脑干内观察到的纤维在锥体束内，对组织进行蛋白激酶Cγ（PKCγ）染色，以检测锥体**（I、J、J*）**缩写：ic，内囊；脑梗；py，锥体束。比例尺输入**（A、B、F、G）**=250μm，**（C、H）**=200微米；**（D、E、I）**=500微米；**（J，J*）**=150μm。

图5
HuNu阳性hNPC丸内玫瑰花结形成。移植后，一些hNPC形成玫瑰花结（白色箭头，**A–D**)神经干细胞（NSC）的典型特征。比例尺**（A，B）**=250μm；**（C、D）**=150微米。

图6
随着时间的推移，移植人iPSC-derived NPC会导致大鼠宿主免疫反应和TN-C表达增加。使用IHC分析移植部位周围的组织，检测IBA-1和GFAP的表达（A-T中的白色箭头表示）以及HuNu和hNCAM，以确定移植部位。在2周的早期时间点(**A、 C类**-低倍率；**B、 D类**-与对照组织相比，IBA-1染色轻度增加**（一）**然而，随着时间的推移，HuNu阳性移植物部位周围的小胶质细胞的免疫反应明显增强(**K、 M（M）**-低倍率；**五十、 N个**-高倍率）与对照组织相比**（S）**同样，GFAP染色在2周早期轻度增加(**E、 G公司**-低倍率；**F、 H（H）**-高倍）与对照组织相比**（J）**。随着时间的推移，这种表达明显增加(**O、问**-低倍率；**P、 R（右）**-高倍）与对照组织相比**（T）**hNPC移植后，移植部位TN-C局部上调**（U–W）**.比例尺输入**（A、C、E、G）**=250μm；**（B、D、F、H–J、L、N、P、R–T、W）**=150μm；**（K、M、O、Q、U、V）**=500微米。

图7
iPSC衍生的hNPC表达深层皮质神经元标记物和祖细胞标记物体内使用抗Tbr1抗体分析皮层神经元标记物Tbr1的表达，结果表明，移植hNPC中有很大一部分表达Tbr1，在4周时共同定位于HuNu阳性细胞内(**A、 B类**，白色箭头）。在所有时间点的WT和α9-eYFP hNPC中都观察到这种表达（数据未显示）。同样，移植后4周时，祖细胞标记物DCX的表达仍保持不变**（C–E）**8周时**（F–H）**hNCAM阳性投射物内移植后（白色箭头**C–H型**). 比例尺输入**（A–H）**=150微米。

图8
iPSC衍生的hNPC保持外源性α9整合素表达长达8周体内在用抗GFP抗体进行IHC分析后，在2周到8周期间检测到外源性α9-eYFP表达。这种表达在整个hNCAM阳性轴突投射中共同定位**（A、C、E）**在2周时，观察到α9-eYFP的表达在整个轴突呈点状**（A，B）**.比例尺输入**（A）**=5μm；**（B）**=2.5微米；**（C）**=25微米；**（D）**=10微米；**（E）**=50微米；**（F）**=20微米。

图9
在发育中未受损的啮齿动物大脑中，增加整合素表达不会导致iPSC-derived hNPC更长的投射。比较了两组中所有43只幼崽的移植（WT和α9-eYFP-hNPC移植）。两组的移植部位（面板**A、 C类**)表明两组均在所有时间点（2周至8周）接受了靶向注射。当比较这两组的轴突投影时（面板**B、 D、E**)结果表明，WT hNPCs项目的轴突距离与距离α9-eYFP hNPC项目相当。2周时，两组均显示出穿过锥体束到达锥体的投射物。同样，在4周时，WT-hNPC将轴突从皮层投射到脑桥（由于小组规模较小，4周时的α9-eYFP-hNPC已从分析中移除）。6周时，WT-hNPC也能投射到脑桥，而α9-eYFP-hNPC仅投射到大脑脚。最后，在第7周和第8周，在脑梗内检测到WT-hNPC投射，并且仅在内囊内检测到α9-eYFP-hNPC。

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