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.2019年2月26日；14（2）：e0212063。
doi:10.1371/journal.pone.0212063。 2019年电子采集。

miR-223-3p和miR-2909对人脂肪干细胞中脂多糖诱导的炎症因子IL-6、IL-1和TNF-α以及TLR4/TLR2/NF-κB/STAT3信号通路的影响

胡安·吴 1, 平牛 1, 赵月强 1, 盐阳城 1, 陈伟平 1, 兰琳 1, 景美路 1, 薛成 1, 徐志良 1
附属公司

miR-223-3p和miR-2909对人脂肪干细胞中脂多糖诱导的炎症因子IL-6、IL-1和TNF-α以及TLR4/TLR2/NF-κB/STAT3信号通路的影响

胡安·吴等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

MicroRNAs（miRNAs）是一种小的非编码RNA分子，在与炎症反应相关的基因表达调控中发挥着重要作用。人类脂肪干细胞具有多潜能分化潜能，从脂肪组织中分离得到。这些细胞主要通过与免疫细胞相互作用和影响免疫因子的分泌来调节炎症；这种互动的细节目前尚不清楚。在目前的研究中，我们成功建立了涉及脂肪干细胞的急性炎症模型和慢性炎症模型。我们使用高通量miRNA微阵列分析来确定在急性和慢性炎症期间显著差异表达的miRNA。脂多糖（LPS）显著降低miR-223-3P和miR-2909的表达（p<0.05），同时通过Toll样受体（TLR）4/TLR2/核因子（NF）-κB/信号转导子和转录激活子（STAT）促进促炎细胞因子、白细胞介素（IL）6、IL-1β和肿瘤坏死因子（TNF）-α的产生3人脂肪干细胞中的信号通路。此外，在IL-6刺激的激活过程中，miR-223-3P在人类脂肪干细胞中的表达显著降低（p<0.05）。miR-223-3P的诱导性下调导致STAT3的激活，STAT3被miR-223-3P直接靶向。STAT3直接靶向TLR4和TLR2，促进促炎细胞因子IL-6的产生，并形成正反馈回路来调节IL-6水平。同样，TNF-α显著增加miR-223-3p的表达（p<0.05），LPS和TLR4/TLR2/NF-κB/STAT3形成负反馈环来调节TNF-β水平。此外，依赖NF-κB的miR-2909靶向Kleeppel-like factor（KLF）4，以调节促炎细胞因子、IL-6、IL-1β和TNF-α的水平。我们得出结论，miR-223-3p和miR-2909在LPS刺激的脂肪干细胞中与促炎因子和信号通路形成了一个复杂的调节网络。这些发现将为针对自身免疫性和炎症性疾病的治疗方法的发展提供信息。

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数字

图1
图1。脂肪干细胞急性炎症模型中的CCK8、QPCR、ELISA和western blot检测。
（A） CCK8检测急性脂肪干细胞炎症模型中细胞活性的结果。（B-D）IL-6、IL-1β、TNF-α的ELISA结果。IL-6、IL-1β和TNF-α的（E-G）QPCR结果。（H-I）TLR4和TLR2的QPCR结果。（J） TLR4和TLR2的蛋白质印迹结果。数据是三个独立实验（n=3）的平均值±SD。***p<0.001；**p<0.01；*p<0.05。
图2
图2。脂肪干细胞慢性炎症模型中的CCK8、QPCR、ELISA和Western印迹检测。
（A） CCK8检测慢性脂肪干细胞炎症模型中细胞活性的结果。IL-6、IL-1β、TNF-α的（B-D）ELISA结果。IL-6、IL-1β和TNF-α的（E-G）QPCR结果。（H-I）TLR4和TLR2的QPCR结果。（J） TLR4和TLR2的蛋白质印迹结果。数据是三个独立实验（n=3）的平均值±SD。***p<0.001；**p<0.01；*p<0.05。
图3
图3。miRNA微阵列分析结果的qPCR验证。
急性炎症模型组和慢性炎症模型组miR-96-5p（A）、miR-126-3p（B）、miR-126-5p（C）、miR133a-3p（D）、miR141-3p（E）、miR.150-3p（F）、miR 223-3p（G）和miR-2909（H）的相对表达。所有实验重复三次，并用2-ΔΔCt法进行分析。***p<0.001；**p<0.01；*p<0.05。
图4
图4。使用四种用于文氏图聚集分析的靶基因预测软件，分析急性和慢性炎症模型中显著差异表达的11个miRNAs。
miR-96-5p（A）、miRNA-126-3P（B）、miRNA-126-5p（C）、miR-141-3P。
图5
图5。差异表达miRNAs的热图，以及与可能的靶基因相对应的功能和通路分析。
（A） 三组差异表达miRNAs的热图分析（正常组N：正常，急性炎症模型组A：急性，慢性炎症模型组C：慢性）。列和行表示样本和特定miRNAs。miRNA簇树如左图所示。图例上的代码是log2转换后的值。色标表示miRNA的相对表达水平。红色表示治疗组miRNA的表达高于对照组，绿色表示治疗组的miRNA表达低于对照组。黑色表示两组miRNA没有差异。（B） 对正常组和急性炎症模型组中差异表达的miRNAs预测的靶基因进行GO分析。（C） 对正常组和慢性炎症模型组中差异表达的miRNAs预测的靶基因进行GO分析。GO类别显示在x轴上，基因数量显示在y轴上。生物过程（BP）是GO分析的主要类别，包括与炎症相关的各种过程。分子功能（MF）富含蛋白质结合、锌离子结合、转录因子活性等。细胞核中富含细胞成分（CC），是膜、细胞质等不可缺少的成分分析正常组和急性炎症模型组中差异表达的miRNA预测的靶基因通路。（E） 分析正常组和急性炎症模型组中差异表达的miRNAs预测的靶基因通路。根据P值选择了15种最丰富的信号转导途径（P<0.01）。x轴表示信号路径项，y轴表示富集程度。
图6
图6。靶向STAT3和IL-6的miR-223-3P双荧光素酶检测；miR-2909靶向KLF4。
（A） miR-223-3P和STAT3的预测结合位点，（B）添加的STAT3 3'-UTR pMIR-TM荧光素酶载体和miR-223-4p模拟物的荧光素素酶活性变化添加的IL-6 3'-UTR psi-CHECK2荧光素酶载体和miR-223-3p模拟物荧光素素酶活性的变化，（G）添加的miR-223-4p模拟物的IL-6分子水平，（H）添加的miR-223-3模拟物的IL-6蛋白水平，（I）miR-2909和KLF4预测的结合位点，（J）添加的KLF4 3'-UTR pMIR-GFP荧光素酶载体和miR-2909模拟物荧光素素酶活性的变化，（K）添加的KLF4和miR-2909的分子水平，（L）添加的KLF4和miR-2909的蛋白质水平。***p<0.001；**p<0.01；*p<0.05。
图7
图7。将miR-223-3p模拟和对照、miR-223-3p抑制剂和抑制剂对照转染到脂肪干细胞中。
IL-6、TNF-α、IL-1β、TLR4、TLR2、miR-223-3p和STAT3的分子表达水平和蛋白表达水平。IL-6、TNF-α、IL-1β的（A-C）蛋白水平，IL-6、TNF-α的（D-J）分子水平，IL-1β、miR-223-3p、STAT3、TLR4、TLR2的（K）蛋白水平。***p<0.001；**p<0.01；*p<0.05。
图8
图8。miR-223-3p直接调节TLR2、TLR4和炎症细胞因子IL-6、TNF-α和IL-1β的分泌。
（A） STAT3 siRNA转染后的STAT3蛋白水平，（B-D）miR-223-3p和STAT3 siRNA转染后IL-6、TNF-α、IL-1β的蛋白表达，（E-I）TLR2、TLR4、IL-6的分子表达水平。TLR2和TLR4的TNF-α和IL-1β，（J）蛋白表达。***p<0.001；**p<0.01；*p<0.05。
图9
图9。分别将STAT3和p-STAT3抑制剂转染脂肪干细胞，检测STAT3、TLR4、TLR2、IL-6、TNF-α、IL-1β的分子表达水平和蛋白表达水平。
（A-C）IL-6、TNF-α、IL-1β蛋白水平，（D-I）IL-6，TNF-β，IL-1β，STAT3，TLR4，TLR2分子表达水平，（J）TLR4、TLR2、STAT3、p-STAT3蛋白表达水平。***p<0.001；**p<0.01；*p<0.05。
图10
图10。分别将IL-6、siIL-6、TNF-α和siTNF-β转染脂肪干细胞，检测miR-223-3p、STAT3和pSTAT3的表达。
转染IL-6后的（A-B）mir-223-3p和STAT3分子表达，siIL-6转染后的（C）STAT3蛋白表达，IL-6、siIL-6、（E-F转染siTNF-α、（H）STAT3后STAT3蛋白表达和转染TNF-β和siTNF--α后pSTAT3蛋白质表达。***p<0.001；**p<0.01；*p＜0.05。
图11
图11。miR-2909依赖NF-kB靶向KLF4调节IL-6、IL-1β、TNF-α。
将miR-2909模拟物和对照物、miR-2909inhibitor和inhibitor-control以及NF-kB抑制剂分别转染脂肪干细胞，（A-C）IL-6、IL-1β和TNF-α的蛋白表达水平，（D-I）IL-6，IL-1β，TNF-β，miR-2909-，KLF4，NF-kB的分子表达水平，pNF-kB.***p<0.001；**p<0.01；*p<0.05。
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