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.2019年5月8日;39(19):3752-3769.
doi:10.1523/JNEUROSCI.2070-18.2019。 Epub 2019年2月22日。

转位蛋白配体对帕金森综合征MPTP小鼠模型神经变性的保护作用

附属公司

转位蛋白配体对帕金森综合征MPTP小鼠模型神经变性的保护作用

精工等。 神经科学. .

摘要

帕金森病是继阿尔茨海默病之后第二常见的神经退行性疾病。帕金森氏病是一种运动障碍,其特征是由于黑质多巴胺能神经元的丢失而引起的运动障碍。虽然多巴胺前体左旋多巴和多巴胺激动剂的对症治疗可以改善运动症状,但目前尚不存在任何疾病改善治疗。在这里,我们发现Emapunil(AC-5216,XBD-173),一种转运蛋白18的合成配体,在接受MPTP治疗的雌性小鼠中,作为帕金森病模型,可以改善多巴胺能神经元的退化,保护纹状体多巴胺代谢,并防止运动功能障碍。我们发现Emapunil调节肌醇需要激酶1α(IREα)/X-box结合蛋白1(XBP1)未折叠蛋白反应途径,并诱导从促炎向抗炎小胶质细胞活化的转变。此前,在一项II期临床试验中,埃马普尼被证明能够跨越血脑屏障,并且安全、耐受性良好。因此,我们的数据表明,Emapunil可能是治疗帕金森病的一种很有前途的方法。重要性声明我们的研究揭示了埃马普尼对帕金森综合征MPTP小鼠模型多巴胺能神经元存活、多巴胺代谢和运动表型的有益影响。此外,我们的工作揭示了介导埃马普尼神经保护作用的分子网络,包括小胶质细胞激活状态和未折叠蛋白反应途径。这些发现不仅有助于我们理解易位蛋白18(TSPO)功能的生物学机制,而且还表明易位蛋白质18可能是一个有前景的治疗靶点。因此,我们建议在其他帕金森病小鼠模型和随后的帕金森病临床试验中进一步验证埃马普尼。

关键词:MPTP;帕金森病;TSPO;小胶质细胞;神经变性。

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数字

图1。
图1。
试剂和条件。、NaOEt、EtOH、0°C-80°C、4小时、81%。b条、POCl90°C,4小时,99%。c(c)、甘氨酸等N、 乙醇,78°C,4小时,100%。d日,N个-乙基苄胺、PyBOP等N、 DMF,22°C,2小时,100%。e(电子)、NaOH、EtOH、水、78°C、2小时、82%。(f),二苯基叠氮化磷,等N、 DMF,100°C,6小时,55%。、甲烷、氢氧化钠、DMF、22°C、3小时、78%。
图2。
图2。
实验设计。将8周龄雌性C57BL/6JRj小鼠分为三个不同的实验治疗组:Top组、NaCl组。中间,MPTP+DMSO组。底部,MPTP+Emapunil组。动物在随后的5天(第1-5天)每天腹腔注射一次氯化钠或30 mg/kg体重的MPTP。MPTP+Emapunil组的动物从第1天到第15天,每隔一天腹腔注射50 mg/kg体重的Emapuni。第3天,每组5只动物被杀;制备纹状体和黑质,并休克冷冻以通过qPCR、HPLC和转录组进行进一步分析。其余动物分别在第11-13天(极性试验)和第14天(圆柱体试验)进行运动功能试验。在第15天对动物进行灌注,并对大脑进行冷冻以进行进一步体视学分析。
图3。
图3。
Emapunil改善MPTP诱导的多巴胺能神经元丢失。A类,NaCl(顶部)、MPTP(中部)或MPTP和Emapunil(底部)处理的小鼠黑质的代表性图像(抗TH抗体染色)。比例尺,200μm。B类多巴胺能神经元被量化为TH-免疫活性神经元的总数。C类在NaCl、MPTP或MPTP和Emapunil治疗组中,对Nissl染色神经元的数量进行量化。单因素方差分析,组间差异:第页<0.0001(TH和Nissl染色神经元)*第页< 0.05; ***第页< 0.001; Tukey的事后(post-hoc)测试。
图4。
图4。
埃马普尼治疗可恢复运动功能。A类第一次施用MPTP 14天后,用NaCl(黑条)、MPTP(红条)或MPTP+Emapunil(绿条)处理的小鼠进行圆筒试验。直方图表示后部相对于气缸壁的百分比,可以是没有爪子支撑的自由后部,也可以是只有左侧、右侧或双爪支撑的后部。对于仅用右或左爪子辅助的后肢,未观察到组间差异。单因素方差分析,组间差异:第页=0.000108(自由后部)和第页=0.003677(用双爪支撑)*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001; Tukey的事后(post-hoc)测试。B类,首次MPTP剂量后11–13天的电极测试性能。直方图表示在极点顶部向下定向所需的时间。单因素方差分析,组间差异:第页= 0.04. *第页<0.05(Tukey's事后(post-hoc)测试)。
图5。
图5。
纹状体多巴胺及其代谢物的HPLC分析。A类,多巴胺。B类、DOPAC。C类、代谢率(HVA+DOPAC)/多巴胺。单因素方差分析,组间差异:第页<0.0001(多巴胺),第页=0.02(DOPAC),以及第页=0.0008(代谢率)*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001; Tukey的事后(post-hoc)测试。
图6。
图6。
Emapunil缓解ER压力。A类、qPCR分析未片段化的相对mRNA表达水平新业务流程1.B类,qPCR分析剪接的相对mRNA表达水平Xbp1型.C类,拼接比例Xbp1型/未分割X业务流程1归一化为NaCl控制。单因素方差分析,组间差异:第页= 0.25329 (新业务流程1),第页<0.0001(拼接Xbp1型)、和第页=0.003151(比率Xbp1型/新业务流程1). **第页< 0.01; ***第页< 0.001; Tukey的事后(post-hoc)测试。D类,通过腺苷酸激酶释放(相对ToxiLight发光)测定DMSO、MPP处理的分化LUHMES细胞的细胞毒性+或鱼藤酮,并添加或不添加埃马普尼。双向方差分析,在所有交互比较中:第页< 0.0001. *第页< 0.05; ***第页< 0.001; 霍尔姆-西达克事后(post-hoc)测试。E类,XBP1型/XBP1型LUHMES细胞中的比率。单因素方差分析,组间差异:第页< 0.0001. **第页< 0.01; ***第页< 0.001; Tukey的事后(post-hoc)测试。
图7。
图7。
多巴胺能神经元中TSPO的表达。A类,8周龄WT对照小鼠(黑质)的免疫荧光染色。切片用TSPO抗体(左,绿色)和TH抗体(中,红色)染色。对,合并图像。比例尺,20μm。B类,LUHMES细胞免疫荧光染色。左图,DAPI(蓝色),TSPO抗体(绿色),β-III微管蛋白抗体(红色)。右,合并图像。比例尺,50μm。C类Western blot分析LUHMES细胞中TSPO的表达。
图8。
图8。
TSPO siRNA处理降低TSPO表达水平。A类Western blot分析LUHMES细胞中TSPO、β-actin和TH水平,有无针对TSPO的siRNA。B类TSPO水平的量化(Western blot分析A类)归一化为β-actin(负荷控制)。双尾未配对t吨测试(韦尔奇t吨测试):第页= 0.0048. **第页< 0.005.C类TH水平的量化(Western blot分析A类)归一化为β-actin(负荷控制)。双尾未配对t吨测试(韦尔奇t吨测试):第页= 0.412. n.s.=不重要。
图9。
图9。
Emapunil的作用取决于TSPO的表达。A类,通过腺苷酸激酶释放(ToxiLight发光)测定经TSPO或对照siRNA处理的分化LUHMES细胞的细胞毒性。实验组:DMSO,10μ鱼藤酮,5μ埃马普尼,10μ鱼藤酮加5μ埃马普尼。双向方差分析:F类(3,54)= 3.365,第页= 0.0251. **第页< 0.005; ***第页< 0.001; 图基牌手表事后(post-hoc)测试。B类,鱼藤酮浓度增加对分化的LUHMES细胞的细胞毒性(ToxiLight发光分析)。单因素方差分析,组间差异:第页<0.0001***第页<0.001(图基事后(post-hoc)测试)。C类,拼接的qPCR分析XBP1型/未分割的XBP1型用TSPO或对照siRNA处理分化的LUHMES细胞A类.双向方差分析:F类(3,82)= 6.458,第页= 0.0006. **第页< 0.005; ***第页< 0.001; 图基牌手表事后(post-hoc)测试。n.s.=不重要。
图10。
图10。
埃马普尼预防MPTP动物的微胶质增生和星形胶质增生。A类NaCl、MPTP+DMSO或MPTP+Emapunil处理小鼠纹状体切片的IBA1(绿色)免疫组化,于第15天处死。B类NaCl、MPTP+DMSO或MPTP+Emapunil处理小鼠纹状体切片的GFAP(红色)免疫组化,于第15天处死。C类,IBA1阳性细胞(纹状体)的定量。D类,GFAP阳性细胞(纹状体)。数据为总数/mm2每只动物的三个切片用n个=每组6或7只动物。单因素方差分析,组间差异:第页<0.0001(IBA1和GFAP定量)***第页<0.001(Tukey's事后(post-hoc)测试)。比例尺:A类,50微米;B类,100微米。n.s.=不重要。
图11。
图11。
埃马普尼介导由促炎症基因表达向抗炎基因表达的转变。在第3天从NaCl(黑条)、MPTP+DMSO(红条)或MPTP+Emapunil(绿条)处理的小鼠中分离出纹状体RNA(n个=每个实验组5个)。mRNA表达的qPCR分析:A类,伊巴1.B类,Tspo公司.C类,促炎细胞因子和趋化因子。D类,抗炎细胞因子和趋化因子。直方图表示根据NaCl控制条件标准化的相对mRNA水平。单因素方差分析,组间差异:第页= 0.000163 (伊巴1),第页= 0.001157 (Tspo公司),第页= 0.000151 (Tnfa公司),第页< 0.0001 (Cxcl10公司),第页= 0.004103 (伊尔1b),第页= 0.81803 (百万帕2升),第页= 0.0039 (伊尔6),第页= 0.019653 (2个),第页= 0.000377 (Cox2公司),第页= 0.015957 (精氨酸1),第页= 0.008185 (Il10号机组),第页= 0.0895 (Il4号机组),第页= 0.00057 (第一夫人),第页= 0.000336 (Ym1年),第页= 0.000169 (菲兹2). *第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001; Tukey的事后(post-hoc)测试。n.s.=不重要。
图12。
图12。
MPTP和Emapunil对转录组的影响。A类维恩图显示了对MPTP和Emapunil的转录反应之间的重叠,以及仅受MPTP治疗或仅受额外Emapuni治疗(MPTP+Emapuni1)影响的基因之间的重叠。B类,仅在MPTP组中显著的183个基因的个体踪迹(即通过埃马普尼治疗减弱)。对,这183个基因中上调和下调基因的最显著的基因本体(GO)类别被表示出来。C类,与Emapunil-特异基因相关的GO术语网络(即维恩图中的1630个A类仅在MPTP+Emapunil治疗组中发生变化,但在MPTP组中没有变化)。LFC,对数折叠变化。

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