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.2019年2月20:8:e44396。
doi:10.7554/eLife.44396。

Schnyder角膜营养不良相关UBIAD1抑制小鼠内质网相关HMG-CoA还原酶降解

附属公司

Schnyder角膜营养不良相关UBIAD1抑制小鼠内质网相关HMG-CoA还原酶降解

尤加·乔等。 埃利夫. .

摘要

自体显性Schnyder角膜营养不良症(SCD)的特征是由于胆固醇过度积累导致角膜混浊。SCD是由UBIAD1基因突变引起的,该基因利用香叶基香叶基焦磷酸(GGpp)合成维生素K2使用培养的细胞,我们先前发现甾醇会触发UBIAD1与胆固醇生物合成酶HMG-CoA还原酶(HMGCR)的结合,从而抑制其内质网相关降解(ERAD)(Schumacher等人,2015)。GGpp触发HMGCR释放UBIAD1,从而实现UBIAD的最大ERAD和ER-高尔基体转运。SCD-相关UBIAD1可抵抗GGpp诱导的释放,并被隔离在ER中以抑制ERAD。我们现在报告,表达SCD-关联UBIAD的敲除小鼠在多个组织中积累HMGCR,这是由于ER隔离突变UBIAD和抑制HMGCR ERAD所致。来自衰老敲除小鼠的角膜表现出混浊和甾醇过度积累的迹象。这些结果确立了UBIAD1在胆固醇稳态中的生理意义,并表明抑制HMGCR ERAD有助于SCD发病。

关键词:ER相关降解;施奈德角膜营养不良;生物化学;细胞生物学;化学生物学;胆固醇;香叶基香叶基焦磷酸;类异戊二烯;小鼠;维生素K。

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数字

图1。
图1.HMGCR蛋白在小鼠肝脏中的积累优比亚德1基/基具有混合C57BL/6×129遗传背景的小鼠。
(A类)小鼠UBIAD1蛋白的氨基酸序列和预测拓扑结构。天门冬氨酸-100(N100)是SCD中最常见的突变氨基酸残基,它被放大,用红色阴影表示,并用箭头表示。(B类)男WT,乌比亚1重量/Ki,以及乌比亚1基/基给窝友(8-9周龄,每组8只小鼠)喂食随意祭祀前先吃东西。按照“材料和方法”中的描述,采集小鼠的肝脏并进行亚细胞分离将每组所得膜(Memb.)和核提取物(N.E.)组分(总蛋白80–160µg/条)的等分样品进行混合,并进行SDS-PAGE,然后使用内源性HMGCR、SREBP-1、SREBP-2、UBIAD1、Insig-1、Insig-2、calnexin和LSD-1抗体进行免疫印迹分析。虽然在单独的面板中显示,但LSD-1可作为核SREBP免疫印迹的负荷控制。肝脏HMGCR蛋白的量乌比亚1基/基通过使用ImageJ软件量化HMGCR对应的条带来确定小鼠。
图1——图补充1。
图1-图补充1:WT和乌比亚1基/基老鼠。
(A类)从图1B中使用的小鼠(8只小鼠/组)的肝脏中分离出的总RNA被单独分离。使用针对所示基因的引物对来自单个小鼠的等量RNA进行实时定量RT-PCR;亲环素mRNA作为不变对照。每个值代表与WT小鼠相对的mRNA数量,任意定义为1。酒吧,平均值±S。E.(误差条)八只老鼠的数据。(B类)WT或WT患者肝脏和血浆中胆固醇、甘油三酯和非酯化脂肪酸(NEFA)的含量乌比亚1图1B中使用的敲除小鼠通过“材料和方法”中所述的比色法测定误差线,S.E.公司第页使用Student的t吨试验:*,p≤0.05。,HMG辅酶A合成酶;Fpps公司,法尼基焦磷酸合成酶;平方米角鲨烯合酶;Acs公司乙酰辅酶A合成酶;科目1,乙酰辅酶A羧化酶-1;Fas公司脂肪酸合成酶;第1页,硬脂酰辅酶A去饱和酶-1;格帕特,甘油-3-磷酸酰基转移酶;阿布cg5阿布cg8ATP-结合盒亚家族G成员5和8;全球生产总值,香叶基香叶基焦磷酸合成酶。
图2。
图2.HMGCR蛋白在WT和乌比亚1基/基具有C57BL/6遗传背景的小鼠。
(A和B)8至9周龄男性WT,乌比亚1重量/Ki,以及乌比亚1基/基给窝友(6只/组)喂食随意研究前的饮食。使用针对所示蛋白质的抗体,通过免疫印迹分析均质肝脏、去核眼、肾脏、大脑、睾丸和脾脏的膜(Memb.)和核提取物(N.E.)组分等分(总蛋白/车道23–50µg)。星号表示在来自大脑和胰腺的抗HMGCR免疫印迹中观察到的非特异性交叉反应带。虽然在单独的面板中显示,但LSD-1可作为核SREBP-1和SREBP-2免疫印迹的负荷控制。在(B类)HMGCR蛋白在指定组织中的含量乌比亚1基/基通过使用Image J软件量化HMGCR对应的条带来测定小鼠。(C类)为了进行mRNA分析,对来自单个小鼠指示组织的等量RNA进行定量实时RT-PCR,使用针对mRNA和亲环素mRNA作为不变对照。误差线、瑞典。
图2——图补充1。
图2-补充图1:HMGCR蛋白在WT和乌比亚1基/基老鼠。
女性WT,乌比亚1重量/Ki,以及乌比亚1基/基图2中使用的动物的窝友(每组6只小鼠,8-9周龄)被喂食随意研究前的饮食。均质肝脏膜(Memb.)和核提取物(N.E.)部分的等分样品(A类)和眼球摘除(B类)使用针对所示蛋白质的抗体通过免疫印迹分析(50-80µg/lane总蛋白)。尽管在单独的面板中显示,LSD-1作为核SREBP-1和SREBP-2免疫印迹的负载对照(A类).
图3。
图3 WT和WT中非甾醇类异戊二烯的分析乌比亚1基/基老鼠。
喂食雄性小鼠(10-12周龄,每组5只)随意学习前的饮食。收集肝脏进行亚细胞分馏和免疫印迹分析,使用针对指示蛋白质的抗体对所得膜组分(总蛋白80µg/条)进行分析,或测定甲醌-4(MK-4)、香叶基香叶醇、泛醌-10、叶喹酮和甲醌-7(MK-7)的量如“材料和方法”中所述,通过LC-MS/MS肝组织中MK-4的相对含量乌比亚1基/基通过使维生素K的量正常化来测定小鼠2亚型与使用ImageJ软件定量的UBIAD1蛋白的量的比值。误差线,S.E第页使用Student的t吨测试:*,p<0.05;**,p<0.01。
图3——图补充1。
图3-补充图1.WT和WT不同组织中非甾醇类异戊二烯的分析乌比亚1基/基老鼠。
收集图3所示小鼠的组织,并通过LC-MS/MS测定“材料和方法”中所述的menaquinone-4(MK-4)、香叶基香叶醇和泛醌-10的含量误差线,S.E第页使用Student的t吨测试:*,p<0.05;**,p<0.01。
图4。
图4:来自WT和优比亚德1基/基老鼠。
WT和乌比亚1基/基小鼠在第0天2×10时进行实验5添加10%胎牛血清(FCS)的MEF培养基中每10 cm培养皿中的细胞数。(A类)第3天,收集细胞进行亚细胞分离。将所得膜和核提取物部分的等分样品(35–50µg总蛋白/条)进行SDS-PAGE,然后使用针对所示蛋白的抗体进行免疫印迹分析。(B类)在第3天,收集细胞以测量如“材料和方法”中所述,通过定量RT-PCR测定mRNA水平和使用比色法测定总胆固醇水平(C和D)第2天,在含有10%脂蛋白缺乏血清、10µM致密蛋白钠和50µM甲羟戊酸钠的MEF培养基中,在37°C下培养16小时,去除细胞中的类异戊二烯。随后用1µg/ml 25-HC处理细胞,如图所示;在(D类),细胞也接受10µM MG-132。(C类)在37°C下4小时后,收集细胞以制备膜和核提取物部分(35–50µg总蛋白/条),并用针对所示蛋白的抗体进行免疫印迹分析。(D类)在37°C下培养1小时后,收集细胞,在含有洗涤剂的缓冲液中溶解,并用30µg多克隆抗HMGCR抗体进行免疫沉淀。用IgG-A9(抗HMGCR)和IgG-P4D1(抗泛素)对免疫沉淀的材料进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。
图5。
图5胆固醇喂养的野生动物肝脏中HMGCR的调节,乌比亚1基/基,以及基/基老鼠。
雄性小鼠(12-13周龄,每组5只)被喂食随意连续5天的饮食中添加适量的胆固醇。均质肝脏膜(Memb.)和核提取物(N.E.)部分的等分样品(A和C)或眼球摘除(B类)(70µg蛋白质/车道)通过免疫印迹分析,使用图1图例中所述的针对所示蛋白质的抗体进行分析。星号表示在核SREBP-2免疫印迹中观察到的非特异性条带。(D类)对于mRNA分析,使用针对所示mRNA和亲环素mRNA的引物对来自小鼠肝脏的等量RNA进行定量实时RT-PCR,作为不变对照。误差线、瑞典。件9,前蛋白转化酶枯草杆菌素/可欣9型。
图5——图补充1。
图5:补充图1:饮食胆固醇对WT和WT患者肝脏中Scap-SREBP通路mRNA编码成分表达的影响乌比亚1敲入小鼠。
从图5A中使用的小鼠肝脏中分离出总RNA(5只小鼠/组)。使用针对所示基因的引物对来自单个小鼠的等量RNA进行实时定量RT-PCR;亲环素mRNA作为不变对照。每一个值代表与喂食食物的WT小鼠相对的mRNA数量,随意定义为1。棒材,平均值±S。E.(误差条)五只老鼠的数据。阿波(ApoE),载脂蛋白E;Acat-1型,酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1。
图6。
图6.WT和WT中他汀类药物介导的HMGCR和UBIAD1的调节乌比亚1基/基老鼠。
雄性小鼠(6-8周龄,每组5只)被喂食随意辅以指定量的饮食(A和C)或0.2%(D类)洛伐他汀5天。(A和C)均质肝脏膜和核提取物部分的等分样品(A类)或眼球摘除(C类)(70µg蛋白/lane)通过免疫印迹分析和针对指示蛋白的抗体进行分析。在(B类),肝脏中HMGCR蛋白的量乌比亚1基/基中显示的老鼠(A类)通过使用Image J软件量化HMGCR对应的条带并将其归一化为未经处理的WT对照组中的蛋白质量来确定。(D类)从肝匀浆中获得的核后上清液(PNS)在不连续蔗糖梯度(7.5-45%)上进行分馏,得到富含高尔基的轻膜部分和富含ER的重膜部分。匀浆(裂解液)、核提取物(N.E.)、PNS、富含高尔基膜、,对ER富集的膜进行SDS-PAGE,然后用针对所示蛋白的抗体进行免疫印迹分析。
图6——图补充1。
图6补充图1.洛伐他汀对WT和WT患者肝脏Scap-SREBP通路mRNA编码成分表达的影响优比亚德1敲入小鼠。
从图6A中使用的小鼠(5只小鼠/组)肝脏中分离出总RNA。使用针对所示基因的引物对来自单个小鼠的等量RNA进行实时定量RT-PCR;亲环素mRNA作为不变对照。每一个值代表与喂食食物的WT小鼠相对的mRNA数量,随意定义为1。棒材,平均值±S。E.(误差条)五只老鼠的数据。
图7。
图7。。优比亚德1基/基随着年龄的增长,小鼠表现出角膜混浊的迹象。
(A类)雄性和雌性小鼠(15只体重,24只乌比亚1基/基,50周龄)食用随意通过体视显微镜检查对饮食进行分析。白色箭头表示角膜混浊。(B–E类)小鼠分析(A类)处死角膜,然后用抗HMGCR多克隆抗体进行免疫组织化学染色分析(B类),定量RT-PCR(C类)和LC-MS/MS(D和E)如图1图例和“材料和方法”所述误差线,S.E第页使用Student的t吨测试:*,p<0.05;**,p<0.01;***,0.005页。Dhcr7号图纸,7-脱氢胆固醇还原酶;24-脱氢胆固醇还原酶,24-脱氢胆固醇还原酶;7-脱水装置。,7-脱氢甾醇;8-脱氢苯酚。,8-脱氢胆固醇;7-脱氢苯酚。,7-脱氢胆固醇。
图7——图补充1。
图7——图补遗1。。优比亚德1基/基随着年龄的增长,小鼠表现出角膜混浊的迹象。
雌性小鼠(15重量, 24乌比亚1基/基,50周龄)食用随意如图7所示,通过体视显微镜检查对饮食进行分析。白色箭头表示角膜混浊。

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引用人

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