Interferon Regulatory Factor 3-Mediated Signaling Limits Middle-East Respiratory Syndrome (MERS) Coronavirus Propagation in Cells from an Insectivorous Bat

doi:10.3390/v11020152

.2019年2月13日；11(2):152.

doi:10.3390/v11020152。

干扰素调节因子3介导的信号传导限制中晚期呼吸综合征（MERS）冠状病毒在食虫蝙蝠细胞中的传播

阿林盖·班纳吉¹, 达里尔·法尔扎拉诺^2 三, 诺琳·拉宾⁴, Jocelyne Lew公司⁵, 维克拉姆·米斯拉⁶

附属公司

¹加拿大萨斯喀彻温大学西部兽医学院兽医微生物学系，萨斯卡通，SK S7N 5B4。banera9@mcmaster.ca。
²加拿大萨斯喀彻温大学西部兽医学院兽医微生物学系，萨斯卡通，SK S7N 5B4。darryl.falzarano@usask.ca。
^三疫苗和传染病组织国际疫苗中心，萨斯喀彻温大学，萨斯卡通，SK S7N 5E3，加拿大。darryl.falzarano@usask.ca。
⁴加拿大萨斯喀彻温大学西部兽医学院兽医微生物学系，萨斯卡通，SK S7N 5B4。noreen.rapin@usask.ca。
⁵疫苗和传染病组织-国际疫苗中心（VIDO-Intervac），萨斯喀彻温大学，萨斯卡通，SK S7N 5E3，加拿大。jocelyne.lew@usask.ca。
⁶加拿大萨斯喀彻温大学西部兽医学院兽医微生物学系，萨斯卡通，SK S7N 5B4。vikram.misra@usask.ca。

PMID： 30781790
预防性维修识别码： 2008年6月41日
内政部： 10.3390/v11020152

干扰素调节因子3介导的信号传导限制中晚期呼吸综合征（MERS）冠状病毒在食虫蝙蝠细胞中的传播

阿林盖·班纳吉等。病毒. 2019.

.2019年2月13日；11(2):152.

doi:10.3390/v11020152。

作者

阿林盖·班纳吉¹, 达里尔·法扎拉诺^2 三, 诺琳·拉宾⁴, Jocelyne Lew公司⁵, 维克拉姆·米斯拉⁶

附属公司

¹加拿大萨斯喀彻温大学西部兽医学院兽医微生物学系，萨斯卡通，SK S7N 5B4。banera9@mcmaster.ca。
²加拿大萨斯喀彻温大学西部兽医学院兽医微生物学系，萨斯卡通，SK S7N 5B4。darryl.falzarano@usask.ca。
^三疫苗和传染病组织-国际疫苗中心（VIDO-Intervac），萨斯喀彻温大学，萨斯卡通，SK S7N 5E3，加拿大。darryl.falzarano@usask.ca。
⁴萨斯喀彻温大学西部兽医学院兽医微生物学系，萨斯卡通，SK S7N 5B4，加拿大。noreen.rapin@usask.ca。
⁵疫苗和传染病组织-国际疫苗中心（VIDO-Intervac），萨斯喀彻温大学，萨斯卡通，SK S7N 5E3，加拿大。jocelyne.lew@usask.ca。
⁶加拿大萨斯喀彻温大学西部兽医学院兽医微生物学系，萨斯卡通，SK S7N 5B4。vikram.misra@usask.ca。

PMID： 30781790
预防性维修识别码： PMC6410008项目
内政部： 10.3390/v11020152

摘要

食虫蝙蝠被推测为中东呼吸综合征冠状病毒的祖先宿主。MERS-CoV导致人类疾病，死亡率为35%，并已进化出对抗人类抗病毒反应的蛋白质。由于实验感染MERS-CoV的蝙蝠不会出现疾病迹象，我们测试了这样一种假设，即MERS-CoV在蝙蝠细胞中的复制效率低于人类细胞，因为它无法破坏蝙蝠细胞的抗病毒反应。我们感染了人类和蝙蝠(褐飞虱)并观察到病毒在人类细胞中生长到较高滴度。与蝙蝠细胞不同，MERS-CoV也能有效抑制人类细胞中的抗病毒干扰素β（IFNβ）反应。为了确定干扰素反应的关键介质IRF3是否也调节蝙蝠的反应，我们检测了IRF3对病毒双链RNA合成类似物poly（I:C）的反应。我们观察到蝙蝠IRF3通过核移位和翻译后修饰对poly（I：C）作出反应，这是IRF3激活的标志。小干扰RNA（siRNA）对IRF3的抑制表明，IRF3对poly（I:C）和MERS-CoV诱导的蝙蝠细胞IFNβ的诱导至关重要。我们的研究表明赞河象鼩蝙蝠细胞对MERS-CoV介导的颠覆具有抵抗力。

关键词：IRF3；MERS-CoV；蝙蝠；干扰素。

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作者声明没有竞争性利益。

数字

图1
MERS-CoV复制在蝙蝠细胞中减弱，并且不抑制这些细胞中的IFNβ反应。为了评估MERS-CoV是否会在人类和蝙蝠细胞中以相同的速度复制，我们用MERS-CoV感染人类（MRC5、A549、CaLu3、Huh7）和蝙蝠（Efk3、Tb1-Lu）细胞系，并在几个时间点（通过TCID）评估病毒复制₅₀/毫升）。在指定的时间点，通过qRT-PCR定量IFNβ和TNFα的转录水平。(A类)MERS-CoV在感染了0.01感染单位/细胞（平均±SD）的低感染多重性（MOI）的人类（MRC5）和bat（Efk3）细胞中的复制，n个= 3). (B类)感染10个感染单位/细胞的高MOI的人（MRC5）和蝙蝠（Efk3）细胞中MERS-CoV复制（平均值±SD，n个= 3). (C类)感染0.01感染单位/细胞MOI（平均±SD）的人肺（A549、CaLu3和MRC5）和肝（Huh7）细胞中MERS-CoV复制，n个= 2). (D类)感染0.01感染单位/细胞MOI的食虫蝙蝠肾（Efk3）和肺（Tb1-Lu）细胞中MERS-CoV复制（平均值±SD，n个= 2). (E类)MRC5和Efk3细胞中推测的MERS-CoV受体、二肽基肽酶4（DPP4）转录水平（平均值±SD，n个= 2). (F类)MERS-CoV感染Efk3和MRC5细胞后不同时间的IFNβ转录水平（平均值±SD，n个= 4). (**G公司**)MERS-CoV感染的MRC5和Efk3细胞在几个时间点的TNFα转录水平（平均值±SD，n个= 4). (**H（H）**)MERS-CoV感染后24小时在MRC5和Efk3细胞中观察到细胞病变效应（CPE）（MOI=10）。qRT-PCR结果表示为模拟感染细胞的倍数增加，并归一化为GAPDH值（参见方法）。使用Mann-Whitney计算统计显著性U型对两个独立样本进行测试。SD=标准偏差。n个=生物复制次数。

图2
MERS-CoV在人类细胞中引起明显的细胞病变效应，但在蝙蝠细胞中没有。在用MOI为0.01感染单位/细胞的MERS-CoV感染的人（A549、Huh7、MRC5和CaLu3）和蝙蝠（Efk3和Tb1-Lu）细胞中的细胞病变作用。箭头表示明显的细胞病变效应。hpi=感染后小时数。

图3
在poly（I:C）处理后，人和蝙蝠IRF3定位于细胞核。为了确定bat IRF3是否与人类IRF3一样，通过翻译后修饰和核转位对poly（I:C）介导的激活产生反应，我们对poly-I:C处理和模拟处理的细胞进行了免疫荧光显微镜和免疫印迹。(A类)内源性IRF3在模拟和多聚（I:C）处理的人（MRC5）和蝙蝠（Efk3）细胞中的细胞位置。IRF3被染成红色。GAPDH被染成绿色以突出细胞质，细胞核被染成蓝色。(B类)MRC5和Efk3细胞的平均IRF3荧光比（细胞核：细胞质）（平均值±SD，n个= 5). (C类)模拟和聚（I:C）处理的MRC5和Efk3细胞的细胞核和细胞质部分的免疫印迹。C=细胞质分数，N=核分数，箭头=高分子量IRF3，calnexin=细胞质标记，lamin=核标记。使用Mann-Whitney计算统计显著性U型对两个独立样本进行测试*第页< 0.05. SD=标准偏差。n个=字段数。对于原始的全尺寸吸墨纸，见图S1。

图4
IRF3是人和蝙蝠细胞对poly（I:C）应答的干扰素β信号转导所必需的。为了确定IRF3在抗病毒干扰素信号传导中的作用，我们部分敲除了bat（Efk3）和人类（MRC5）细胞中的IRF3，并通过定量实时PCR（qRT-PCR）量化了这些细胞对poly（I:C）的应答中IFNβ转录物的增加。为了进一步证明poly（I:C）介导的IFNβ表达对Efk3细胞中IRF3的依赖性，我们生成了IRF3敲除的bat细胞，并通过定量实时PCR（qRT-PCR）量化了这些细胞中IFNβ转录物的增加，以响应poly（I：C）。(A类)用poly（I:C）刺激IRF3敲低的Efk3细胞（siIRF3）和阴性对照siRNA（ncsiRNA）处理的细胞后，IFNβ转录水平增加了倍（平均值±SD，n个= 4). (B类)用poly（I:C）刺激IRF3敲低MRC5细胞（siIRF3）和阴性对照siRNA（ncsiRNA）处理细胞后，IFNβ转录水平增加了倍（平均值±SD，n个= 4). (C类)为了生成IRF3敲除Efk3细胞，我们使用CRISPR-Cas9删除了基因组DNA中第一外显子的一部分。该示意图表示IRF3缺失细胞系之一Efk3-c3-8细胞中IRF3第一外显子的缺失。野生型细胞（Efk3-WT）中的“ATG”标志着IRF3的起始密码子。类似的核苷酸用“*”表示。(D类)IRF3敲除的蝙蝠细胞（IRF3-KO细胞）和野生型蝙蝠细胞中IFNβ转录水平增加了一倍。免疫印迹证实了IRF3敲除和敲除（蛋白质组；图A、B、D）。结果表示为模拟poly（I:C）转染细胞的倍数增加，并归一化为GAPDH值（见方法）。使用Mann-Whitney计算统计显著性U型对两个独立样本进行测试*第页< 0.05. SD=标准偏差。n个=生物复制次数。对于全尺寸螺栓，见图S2和S3。

图5
IRF3的减少（敲除）或缺失（敲除）增加了大棕蝙蝠细胞中MERS-CoV的水平，并减少了IFNβ转录物。为了确定IRF3介导的信号是否对限制大棕蝙蝠细胞中MERS-CoV复制至关重要，我们敲除了蝙蝠（Efk3）和人类（MRC5）细胞中的IRF3，并用MERS-CoV感染它们。病毒繁殖研究使用0.01或0.1感染单位/细胞的感染多重性（MOI），细胞因子研究使用10感染单位/电池的MOI。我们通过TCID定量了这些细胞中的病毒复制₅₀用qRT-PCR 24 hpi检测感染后48小时（hpi）的IFNβ和OAS1转录物。(A类)分别用人或bat siIRF3（IRF3敲除）或ncsiRNA（模拟/无IRF3击落）处理的MRC5和Efk3细胞中的MERS-CoV滴度为48 hpi（平均值±SD，n个= 4). 免疫印迹（蛋白质组）证实了siRNA在MRC5和Efk3细胞中敲除IRF3。MERS-CoV感染采用0.01感染单位/细胞的MOI。(B类)感染MERS-CoV的siIRF3（IRF3敲除）或ncsiRNA（模拟/不敲除IRF3）处理的Efk3和MRC5细胞中IFNβ转录水平的折叠变化（平均值±SD，n个= 4). 感染使用10个感染单位/细胞的MOI。(C类)感染MERS-CoV的经siIRF3（IRF3敲除）或ncsiRNA（模拟/不敲除IRF3）处理的Efk3和MRC5细胞中干扰素刺激基因（OAS1）转录水平的折叠变化（平均值±标准偏差，n个= 4). 感染采用10个感染单位/细胞的MOI。(D类)用MERS-CoV处理48 hpi的Efk3和MRC5细胞后，在siIRF3（IRF3敲除）或ncsiRNA（模拟/无IRF3击落）中观察到细胞病变效应（CPE）。(E类)蝙蝠（Efk3）、人类（MRC5）和IRF3敲除蝙蝠（cr3-8）细胞中MERS-CoV滴度为48 hpi，MOI为0.1感染单位/细胞（平均值±SD，n个= 4). (F类)野生型蝙蝠（Efk3）和IRF3缺失的蝙蝠（cr3-8）细胞中的MERS-CoV滴度在72小时内感染了0.01感染单位/细胞的MOI。qRT-PCR结果表示为模拟感染细胞的倍数增加，并归一化为GAPDH值（见方法）。使用Mann-Whitney计算统计显著性U型对两个独立样本进行测试*第页< 0.05. SD=标准偏差。n个=生物复制次数。对于全尺寸吸墨纸，见图S4。

图6
蝙蝠IRF3核苷酸序列与其人类对应物不同。对其他几种哺乳动物的IRF3核苷酸序列和大棕蝙蝠IRF3序列（粗体）进行比对，以确定相似性。此处表示IRF3核苷酸序列的最大似然树（1000 Bootstrap）。Bar表示每个位点的核苷酸替换。IRF3核苷酸序列信息见表2。

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