TFAP2C-Activated MALAT1 Modulates the Chemoresistance of Docetaxel-Resistant Lung Adenocarcinoma Cells

doi:10.1016/j.omtn.2019.01.005

.2019年3月1:14:567-582。

doi:10.1016/j.omn.2019.01.005。 Epub 2019年1月18日。

TFAP2C-活化的MALAT1调节多西他赛耐药肺腺癌细胞的耐药性

附属公司

¹东南大学中大医院呼吸科，南京；南京大学医学院金陵医院肿瘤内科，南京，江苏210002。
²南京大学医学院金陵医院肿瘤内科，南京，江苏210002。
^三南京医科大学附属江苏肿瘤医院肿瘤内科，江苏省肿瘤研究所，江苏，中国。
⁴中国江苏省苏州市苏州大学第一附属医院肿瘤内科。
⁵南京医科大学第一附属医院肿瘤内科，江苏苏州。
⁶东南大学中大医院呼吸内科，中国南京。电子地址：朱晓丽62@163.com。
⁷南京大学医学院金陵医院肿瘤内科，南京，江苏210002。电子地址：chenlongbang@yeah.net。

PMID： 30771618
预防性维修识别码： PMC6374643型
内政部： 2016年10月10日至2019年9月1日

TFAP2C-活化的MALAT1调节多西他赛耐药肺腺癌细胞的耐药性

陈静（音译）等。摩尔热核酸. 2019.

.2019年3月1:14:567-582。

doi:10.1016/j.omtn.2019.01.005。 Epub 2019年1月18日。

作者

附属公司

¹东南大学中大医院呼吸内科，中国南京；南京大学医学院金陵医院肿瘤内科，南京，江苏210002。
²南京大学医学院金陵医院肿瘤内科，南京，江苏210002。
^三南京医科大学附属江苏省肿瘤医院肿瘤内科，江苏省肿瘤研究所，中国江苏。
⁴中国江苏省苏州市苏州大学第一附属医院肿瘤内科。
⁵南京医科大学第一附属医院肿瘤内科，江苏苏州。
⁶东南大学中大医院呼吸内科，中国南京。电子地址：朱晓丽62@163.com。
⁷南京大学医学院金陵医院肿瘤内科，南京，江苏210002。电子地址：chenlongbang@yeah.net。

PMID： 30771618
预防性维修识别码： PMC6374643型
内政部： 10.1016/j.omtn.2019.01.005

摘要

耐药仍是有效治疗肺腺癌（LUAD）的一大障碍。此前，我们验证了microRNA-200b（miR-200b）在多西他赛（DTX）耐药LUAD细胞形成中的作用。本研究旨在探讨DTX-耐药LUAD细胞中miR-200b低水平的机制。实时逆转录（RT²)应用lncRNA PCR阵列系统，探索可能调控DTX耐药LUAD细胞miR-200b的lncRNA。转移相关肺腺癌转录物1（MALAT1）导致DTX-resistance LUAD细胞中miR-200b水平较低。进行功能分析以确定MALAT1在调节亲本和DTX耐药LUAD细胞的生长和转移中的作用。研究揭示了竞争性内源性RNA（ceRNA）途径的机制。MALAT1通过作为ceRNA调节miR-200b。MALAT1调节LUAD细胞对DTX的敏感性。E2F转录因子3（E2F3）和锌指E盒结合同源盒1（ZEB1）是miR-200b的两个靶点，介导了MALAT1在DTX-耐药LUAD细胞中的功能。转录因子AP-2γ（TFAP2C）和ZEB1激活MALAT1转录。总之，TFAP2C-activated MALAT1通过海绵miR-200b上调E2F3和ZEB1来调节LUAD细胞的耐药性。我们的发现可能为LUAD治疗提供新的治疗靶点和前景。

关键词：LUAD；MALAT1；化学耐药性；miR-200b。

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数字

图1
多西他赛耐药的LUAD细胞中MALAT1表达上调，并在转录后水平（A）和RT调节miR-200b²应用lncRNA PCR阵列系统测量可能参与调节DTX耐药LUAD细胞miR-200b表达的lncRNA的表达水平。将结果与亲代SPC-A1和H1299细胞的结果进行比较。（B）通过qRT-PCR检测三种lncRNA对SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞中miR-200b表达水平的影响。（C）对SPC-A1细胞进行亚细胞分离以确定MALAT1的细胞位置。（D） RNA FISH用于识别MALAT1的位置。（E） RIP实验表明，与对照IgG沉淀相比，Ago2免疫沉淀中MALAT1和miR-200b的富集。（F）预测了MALAT1与miR-200b的两个结合位点。（G）将两个结合位点分别突变（Mut1和Mut2）或同时突变（Mut1/2），并构建到不同的载体中。将野生型（WT）载体和三种突变型载体与miR-200b模拟物或miR-NC共转染SPC-A1/DTX和HEK293T细胞。报告载体归一化为Renilla荧光素酶载体*p<0.05，**p<0.01；无意义。

图2
MALAT1通过影响细胞增殖增强LUAD细胞的化疗耐药性（A）MALAT1过表达对IC的影响₅₀用MTT法测定SPC-A1和H1299细胞的值。（B） MTT法检测MALAT1敲除对SPC-A1/DTX和H1299/DTC细胞对DTX敏感性的影响。（C）代表性集落形成导致转染MALAT1表达载体的SPC-A1细胞和转染MARAT1 shRNA的SPC-A1/DTX细胞。比例尺为200μm*p<0.05，**p<0.01。

图3
调节失调的MALAT1影响细胞凋亡率和细胞周期分布（A）流式细胞术分析转染pcDNA3.1空载体或pcDNA3.1/MALAT1的SPC-A1细胞在接受或不接受DTX治疗的情况下的凋亡，或转染shCtrl或shMALAT1的SPC-A1/DTX细胞在接受和不接受DTX治疗的情况下流式细胞仪的凋亡。（B）指示细胞中细胞周期分布的流式细胞术分析*p<0.05，**p<0.01。

图4
MALAT1参与亲本和DTX耐药LUAD细胞的EMT过程（A）SPC-A1和SPC-A1/DTX细胞的形态。（B）转染pcDNA3.1或pcDNA3.1/MALAT1的SPC-A1细胞和转染shRNA或shMALAT1的SPC-A1/DTX细胞中E-cadherin和N-cadherin的蛋白水平。（C）用免疫荧光染色法测定指示细胞中E-cadherin和N-cadherin的水平。比例尺为200μm*p<0.05，**p<0.01。

图5
敲除MALAT1抑制DTX耐药LUAD细胞的生长和转移*在体内*（A）在PBS或DTX条件下，测量转染shMALAT1或shCtrl的LUAD细胞衍生的肿瘤。（B）测量肿瘤体积。（C）计算肿瘤重量。（E）用抗E-cadherin和N-cadherin抗体对肿瘤切片进行免疫组织化学（IHC）染色。（F）肿瘤组织TUNEL染色检测凋亡。比例尺，50μm。（G）建立荧光素酶异种移植小鼠模型，以证明MALAT1对肿瘤转移的影响体内; 整个肺都被可视化了。比例尺，100μm*p<0.05，**p<0.01。

图6
MALAT1通过启动miR-200b来增加E2F3和ZEB1的表达，从而促进LUAD的耐药性（A）来自三种在线分析工具TargetScan的重叠mRNA(http://www.targetscan.org/)，RNA22(http://www.rna-seqblog.com/rna22-version-2-0-mirna-mre-pre-peditions/)，和PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de)，用维恩图标识。（B）这些mRNA在SPC-A1/DTX和SPC-A1细胞中的水平在H1299/DTX和H1299细胞中进行了测量和验证。（C）转染pcDNA-MALAT1或联合转染miR-200b模拟物的亲代细胞中E2F3和ZEB1的mRNA水平。（D）转染sh-MALAT1或联合转染miR-200b抑制剂的DTX耐药细胞中E2F3和ZEB1的mRNA水平。（E） RIP分析用于确定Ago2复合物中是否存在MALAT1和E2F3/ZEB1。（F）进行双荧光素酶报告分析以确认miR-200b、MALAT1和ZEB1或E2F3的相关性*p<0.05，**p<0.01；不另作说明，无意义。

图7
通过miR-200b介导MALAT1在LUAD细胞中的生物学作用，并进行E2F3（A）MTT分析，以确定联合转染MARAT1和miR-200b-mimics或sh-E2F3或sh-ZEB1的SPC-A1细胞的DTX敏感性。（B）采用MTT法测定与shMALAT1和miR-200b抑制剂或E2F3或ZEB1共转染的SPC-A1/DTX细胞的DTX敏感性。（C）集落形成分析用于评估与shMALAT1和miR-200b抑制剂或E2F3/ZEB1过表达载体共同转染的SPC-A1/DTX细胞的增殖能力。（D）流式细胞术检测shMALAT1和miR-200b抑制剂或E2F3/ZEB1表达载体共转染SPC-A1/DTX细胞的凋亡率。（E） Western blot分析用于检测与shMALAT1和miR-200b抑制剂或E2F3/ZEB1表达载体共转染的SPC-A1/DTX细胞中的EMT标记*p<0.05，**p<0.01；不另作说明，无意义。

图8
在LUAD细胞中TFAP2C和ZEB1转录激活的MALAT1（A）生物素标记的MALAT1启动子与从SPC-A1或SPC-A1/DTX分离的核提取物混合。然后用质谱法分析洗脱的蛋白质。（B） TFAP2C在MALAT1和ZEB1启动子上的结合区域（>hg19 dna范围=chr11:65264902-65265225；strand=+和>hg19-dna范围=chr 10:31607523-31608038；strand=+），以及ZEB1在MALAT1启动子上结合区域（>hg19-dna范围=chr11:65263903-65264418；strand=+）。（C）用qRT-PCR和western blot检测TFAP2C在DTX-resistant LUAD细胞及其亲代细胞中的表达水平。（D）用qRT-PCR方法分析转染sh/TFAP2C或sh-ZEB1 48h的SPC-A1/DTX或H1299/DTX细胞中MALAT1的表达。（F）使用抗ZEB1或抗TFAP2C或抗IgG抗体进行ChIP分析，以测定SPC-A1/DTX细胞中ZEB1和TFAP2C对MALAT1启动子的亲和力和TFAP2对ZEB1启动子的亲合力。（G）在ChIP试验中，GAPDH用作阳性对照*p<0.05，**p<0.001，***p<0.001。

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