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.2019年4月；110(4):1317-1330.
doi:10.1111/cas.13974。 Epub 2019年3月18日。

Rap1信号调节剂控制骨髓中造血祖细胞的维持和成人长期造血

Takahiko Imai公司 1, 田中弘子 1, 滨崎洋子 2, Nagahiro Minato公司 1
附属公司

Rap1信号调节剂控制骨髓中造血祖细胞的维持和成人长期造血

Takahiko Imai公司等。 癌症科学. 2019年4月.

摘要

成人的长期造血依赖于维持骨髓（BM）小生境中的造血干/祖细胞（HSPC），在那里它们的静止、自我更新和造血分化的平衡受到严格调节。虽然已经确定了产生生态位因子的各种BM基质细胞，但HSPC对生态位因子固有反应性的调节仍不明确。我们之前曾报道过Sipa1（一种Rap1 GTPase激活蛋白）缺失的小鼠会出现多种迟发性造血障碍。在这里，我们发现，移植表达膜靶向C3G（C3G-F）（Rap1 GTP/GDP交换器）的骨髓细胞，导致骨髓中HSPC数量随着时间的推移而逐渐减少，并损害所有细胞系的长期造血。C3G-F/HSPC在脾脏中维持了数月，保留了造血潜能，但这些细胞对整体造血重建的贡献不足。C3G-F/HSPC对干细胞因子（SCF）的反应表现为增殖和分化增强，祖细胞衰竭加速。使用Ba/F3细胞系，我们证实，随着基础Rap1GTP水平的增加和C3G-F的表达，通过SCF连接，导致c-Kit受体和下游信号的激活显著延长。与Vect/HSPC相比，少量C3G-F/HSPC患者在血小板生成素（TPO）的存在下也表现出增殖增强。目前的结果表明，HSPC的基础Rap1激活状态在维持BM中的长期成人造血中起着重要作用。

关键词：骨髓移植；c-Kit；造血祖细胞；说唱信号；干细胞因子。

PubMed免责声明

利益冲突声明

N.M.获得住友大日本制药公司的研究资助。H.T和Y.H获得了武田科学基金会的研究资助。另一位作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
法尼化C3G/骨髓细胞骨髓移植(C3G‐F公司/BMC公司)导致BM公司造血干/祖细胞具有脾脏偏好和长期造血功能受损。A、 B，林−富含造血祖细胞（HPCs）的细胞BMC公司从5-氟尿嘧啶处理的B6小鼠中获得，使用涂有谱系标记抗体混合物的磁珠，并用空的(兽医)（开圆圈）或C3G‐F公司内含内部核糖体进入位点/增强型绿色荧光蛋白逆转录病毒（实心圈）BXH公司‐2添加干细胞因子、白细胞介素的培养基(伊利诺伊州)‐6,伊利诺伊州‐11和Flt3‐L，带旋穴。48小时后，GFP公司 +单元格排序使用FACS公司阿里亚二并以2×10的剂量移植到8.5Gy辐射小鼠体内4细胞/小鼠。用于5个月后的分析BMT公司，成年胸腺切除小鼠被用作受体，以避免胸腺产生T细胞急性淋巴细胞白血病。之后1周、8周和5个月BMT公司脾脏和BM公司对细胞进行多色分析，以确定GFP公司和造血细胞标记物FACS公司.GFP公司 +外周血细胞重建率（A）和绝对值GFP公司 +Lin的细胞数−第1类+c‐套件+单元格(LSK公司)（B，上部）和光盘150+ 光盘48− LSK公司（B，下部）BM公司测定受者的脾脏。实验独立进行了三到五次，并显示了汇总数据。每组小鼠总数为4只1周，9只8周，6只5个月。平均值和标准偏差个体小鼠的。使用Welch’s进行统计分析t吨测试。NS公司，不显著
图2
图2
法尼化型C3G/骨髓细胞的造血重建活性(C3G‐F公司/BMC公司)低于兽医/ BMC公司在相同的收件人中。A、 实验程序示意图（左）。骨髓移植后不同时期(BMT公司)，外周血(PB（聚丁二烯）)分析白细胞表达GFP公司在…的门口光盘45.1+ 光盘45.2+（蓝色符号）和光盘45.1− 光盘45.2+（红色符号）单元格，并确定它们的相对比例（右）。B、 之后的不同时期BMT公司，小鼠被处死BM公司分析（上部）和脾脏（下部）细胞的GFP公司总计和林−第1类+c‐套件+单元格(LSK公司)在光盘45.1+ 光盘45.2+（蓝色符号）和光盘45.1− 光盘45.2+（红色符号）单元格门，并确定相对比例。受试者数量为在第1、3和5周时进行分析的三只小鼠，以及在12周内进行分析的四只小鼠。手段和标准偏差并用Welch的t吨测试*P（P） < .05, **P（P） < .01
图3
图3
C3G/Lin的法尼化形式−第1类+c‐套件+单元格(C3G‐F公司/LSK公司)维持在脾脏中的造血潜能与骨髓相当(BM公司)C3G‐F公司/LSK公司.A，实验程序示意图。B、 外周血细胞(PB（聚丁二烯）),BM公司和骨髓移植后12周二级受者的脾脏(BMT公司)用多种颜色进行分析FACS公司对于表达式和GFP公司和造血细胞标志物。的比例和单元数GFP公司 +白细胞PB（聚丁二烯）（左）以及GFP公司 + LSK公司在里面BM公司和脾脏（右）BMT公司在收件人中确定GFP公司 +骨髓细胞(BMC公司)从主服务器兽医/BMC公司主持人（开放圈），GFP公司 + BMC公司从主服务器C3G‐F公司/BMC公司主体（实心圆），和GFP公司 +原代脾细胞C3G‐F公司/BMC公司主持人（灰色圆圈）。数据来自两个独立的实验。手段和标准偏差并用Welch的t吨测试。NS、，不显著。C、 已排序GFP公司 + LSK公司来自的单元格BM公司初级的兽医/BMC公司主机（开放列），BM公司主要的C3G‐F公司/BMC公司宿主（实心黑色柱）和主脾C3G‐F公司/BMC公司宿主（灰色柱）在含有造血细胞因子（干细胞因子、白细胞介素）混合物的甲基纤维素培养基中培养(伊利诺伊州）‐3,伊利诺伊州‐6，促红细胞生成素）在500个细胞/皿中培养7天，并计算菌落数。手段和东南方显示了三倍培养物的，并对双尾Student’s进行了统计分析t吨测试（左）。对各组的所有菌落进行汇总并分析其表达GFP公司和血统标记FACS公司和Gr1的比例+Mac1电脑+，等级1−Mac1电脑+、和Lin−细胞已确定（右）
图4
图4
C3G/Lin的法尼酰化形式−第1类+c‐套件+单元格(C3G‐F公司/LSK公司)表现出对干细胞因子的增强增殖和分化反应(SCF公司)加速祖细胞衰竭。A、 林−骨髓(BM公司)用5-氟尿嘧啶处理的B6小鼠的细胞感染空的或C3G‐F公司在存在混合造血因子和多色的情况下分析逆转录病毒的指示标记的表达。c‐Kit表达的直方图GFP公司 + 兽医/ LSK公司和C3G‐F公司/ LSK公司门也用平均荧光强度表示。B、 C，感染后2天，GFP公司 + LSK公司已从中排序兽医和C3G‐F公司转染骨髓细胞(BMC公司)，标记为细胞追踪紫(CTV），饥饿1小时，在无（虚线）或有（实线）标准立方英尺（100纳克/毫升）。在第4天和第8天采集细胞，并用FACS公司（B） ●●●●。手段和东南方指出了两个独立实验中的四个样本，并用双尾Student’st吨测试。还显示了第8天培养井的代表性图片。在第4天和第8天，有线电视用FACS公司总计GFP公司 +,GFP公司 + LSK公司、和GFP公司 + 光盘48− 液化石油气单元门兽医/BMC公司和C3G‐F公司/BMC公司（C，左）。来自两个独立文化的数据被覆盖。第8天，收集培养细胞并分析其在GFP公司 +单元格门（C，右）。平均比例和东南方显示了来自两个独立实验的四个样本中指示的细胞类型，并用双尾Student’s进行了统计分析t吨测试。D、 已排序的GFP公司 + LSK公司从兽医/BMC公司（开放列）和C3G‐F公司/BMC公司（实心柱）在含有造血因子（干细胞因子、白细胞介素）混合物的甲基纤维素培养物中培养(伊利诺伊州）‐3,伊利诺伊州‐6，促红细胞生成素）在500个细胞/皿中培养10天，并计数菌落数（左）。收集菌落，并在2×10的次级甲基纤维素培养基中重新种植4每个培养皿培养12天（右）。手段和东南方显示了三重培养物的，并对双尾Student’s进行了统计分析t吨测试。E、 已排序兽医/LSK公司和C3G‐F公司/LSK公司被标记为有线电视并在没有或存在25 ng/mL血小板生成素的情况下培养(完全用户体验)，以及有线电视是FACS公司在第4天和第8天进行分析。两种独立文化的轮廓相互重叠。NS公司，不显著
图5
图5
Sipa1公司/林−骨髓细胞(BMC公司)显示造血干/祖细胞增加BM公司造血重建受损。A、 Rap1信号中C3G（C3G‐F）和Sipa1法尼基化形式的功能示意图（左）。林− BM公司将来自5-氟尿嘧啶治疗的B6小鼠的细胞逆转录至兽医（开圆圈）或Sipa1公司（闭合圆）和已排序的GFP公司 +细胞以2×10的剂量移植到8.5Gy照射小鼠体内4细胞/鼠标。的百分比GFP公司 +外周血白细胞(PB（聚丁二烯）)骨髓移植后不同时期(BMT公司)由确定FACS公司（右）。手段和标准偏差显示了所示的接收者人数，并用韦尔奇的t吨测试*P（P） < .05, **P（P） < .01. B、，BMC公司和脾细胞BMT公司的收件人兽医/BMC公司（开圆圈，五只老鼠）和Sipa1公司/BMC公司（闭圈，四只小鼠）分析GFP公司、Lin标记、Sca‐1和c‐Kit，以及GFP公司 +林−第1类+c‐套件+单元格(LSK公司)在之后的指定时间确定BMT公司.方法和标准偏差每个时间点显示三到五只小鼠，并用韦尔奇的t吨测试*P（P） < .05. C、，BMC公司来自的收件人兽医/BMC公司（开圆圈，五只老鼠）和Sipa1公司/BMC公司（闭合圆圈，4只小鼠）在4个月时分析GFP公司和直线标记，以及指示的数量GFP公司 +测定细胞类型。手段和标准偏差并用韦尔奇的t吨测试。NS公司，不显著
图6
图6
基础Rap1增加全球技术伙伴水平导致干细胞因子延长(SCF公司)介导的c-Kit受体激活和下游信号传导。A、 Ba/F3细胞系稳定表达c‐套件（c‐Kit‐Ba/F3）逆转录兽医或C3G的法尼基形式(C3G‐F公司). 用免疫印迹法和下拉试验（左）检测细胞中指示蛋白的表达。c‐Kit的细胞表面表达用FACS公司在里面兽医/c‐套件‐Ba/F3（蓝线）和C3G‐F公司/c‐Kit‐Ba/F3（红线）细胞（右）。B、，兽医/c‐套件‐Ba/F3（开放符号）和C3G‐F公司/c‐Kit‐维护在WEHI公司将3种条件培养基饥饿4小时，在没有（虚线）或存在（实线）100 ng/mL的条件下培养SCF公司，并在指定的天数计算活细胞数（左）。将等分的细胞培养在Boyden细胞室的上孔中，有无SCF公司（100 ng/mL），并用传真（右）。手段和东南方显示了三重培养物的，并对双尾Student’s进行了统计分析t吨测试**P（P） < .01. C、，兽医/c‐套件‐Ba/F3（开圈）和C3G‐F公司/c‐Kit‐用SCF公司（100 ng/mL）不同时间，用抗c-Kit抗体免疫沉淀（IP）细胞裂解物，然后用抗p-Y和抗c-Kit抗体免疫印迹（左）。用密度测定法分析p‐c‐Kit的相对信号强度（右）。D、，兽医/c‐套件‐Ba/F3和C3G‐F公司/c‐Kit‐Ba/F3细胞SCF公司（100 ng/mL）进行不同时间的裂解，并用指示的抗体进行免疫印迹（左）。用密度计分析相对信号强度（右）。未裁剪的数字图像如图S7所示
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