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.2019年1月29:11:9。
doi:10.3389/fnagi.2019.00009。 2019年eCollection。

衰老和疾病中伴侣介导的蛋白质分解和蛋白质分解途径之间的串扰

迪奥戈·费雷西亚诺 1, 凯特琳·朱尼曼 1, 曼努埃尔·伊堡 1, 在C Brás 2, 卡琳娜·霍姆伯格 三, 珍妮·柯尔斯坦 1
附属公司

衰老和疾病中伴侣介导的蛋白质分解和蛋白质分解途径之间的串扰

迪奥戈·费雷西亚诺等。 前老化神经科学. .

摘要

功能性蛋白质质量控制机制对维持细胞和生物生理学至关重要。蛋白质稳态网络中的扰动可能导致错误折叠和聚集蛋白质的形成，这是蛋白质构象紊乱和衰老的标志。蛋白质聚集被伴侣的作用抵消，伴侣可以重新溶解聚集的蛋白质。另一种蛋白质聚集清除策略是利用泛素-蛋白酶体系统（UPS）或自噬通过蛋白质水解消除。很少有人知道这三种蛋白聚集体清除策略是如何在生物体内随着衰老或疾病相关蛋白的表达而调节和协调的。为了解开蛋白质聚集清除选项之间的串扰，我们研究了自噬和UPS如何对蛋白质分解能力的扰动作出反应。我们发现自噬是作为一种潜在的补偿机制被诱导的，而在秀丽线虫和HEK293细胞。淀粉样蛋白Aβ的表达3-42和Q40导致自噬以及同一组织内甚至跨组织的UPS受损。我们的数据表明，随着年龄的增长和每个清除机制的能力失衡，蛋白质组网络（PN）的不同节点之间紧密协调。

关键词：秀丽线虫；老化；伴侣；分解；蛋白水解；蛋白质平衡。

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数字

图1
图1
当伴侣解聚酶能力受损时，会诱导自噬。（A）GFP:：LGG-1动物（第6天）接受RNAi以耗尽的荧光图像热休克蛋白-1,热休克蛋白-110和dnj-13型上面板显示动物的头部/肠道区域，下面板是所示区域的放大图。比例尺：50μm（上部）和5μm（下部面板）。（B、C）GFP:：LGG-1 RNAi处理动物的免疫印迹（如A类). 误差条表示至少四个独立实验的标准偏差（SD）（B）虚线表示免疫印迹中的一些车道被删除。（D–F）RNAi处理野生型（wt）动物的LGG-1和SQST-1/p62的相对蛋白质水平（第6天）。误差条表示至少三个独立实验的SD。（G、H）用200 nM Bafilmycin A1（BafA1）处理siRNA转染的HEK293细胞的免疫印迹。将LC3-II水平标准化为α-微管蛋白水平，然后进行siRNA控制（H）误差条表示两个独立实验的SD。（I，J）4、6、8和10天龄线虫的LGG-1和SQST-1/p62水平。所示为第4天标准化的相对LGG-1和SQST-1/p62水平（J）误差条表示至少五个独立实验的SD。（K）RNAi处理的GFP:：LGG-1动物的荧光图像。荧光图像是肠道区域的放大图像，分别在第4天（上部）和第10天（下部）采集。比例尺：5μm。（左）RNAi处理动物第4天、第6天、第8天和第10天的相对LGG-1和SQST-1/p62水平。将数值标准化为当天的对照RNAi。图表示至少两个独立实验的平均值。
图2
图2
伴侣蛋白敲除减少溶酶体池并启动HLH-30向细胞核的易位。（A、B）RNAi处理的第4天大的动物的溶酶体池。LysoTracker-Red荧光的定量和归一化（B）。误差条表示每只至少10只动物的SD。比例尺输入（A）：200微米。（C、D）对RAB-7:：GFP线虫进行RNAi处理4天。上面板显示肠细胞，下面板显示放大区域（C）GFP荧光标准化以控制RNAi（D）。误差条表示至少三只动物的SD。（E、F）HLH-30:：GFP动物接受RNAi治疗4天。显示了HLH-30:：GFP核易位动物的百分比（F）红色三角形表示核HLH-30:：GFP信号（E）对每种情况下的25只动物进行了分析。比例尺：200μm（上部）和50μm（下部面板）。
图3
图3
当HSP-110/70/J机械受到干扰时，蛋白酶体能力降低。（A）UbG76V:：Dendra2在肌肉和神经元细胞中的单细胞光转化方案秀丽线虫.（B、C）RNAi治疗的UbG76V:：Dendra2肌肉动物（B）或神经细胞（C）UbG76V：：在561 nm处转换后3小时（神经元）或24小时（肌肉）分析Dendra2蛋白。（B）误差条表示至少九只动物的SD。（D、E）siRNA转染HEK293细胞表达UbG76V-GFP的免疫印迹。用20μM MG-132处理4 h的细胞作为对照。显示了相对UbG76V-GFP水平（E）。误差条表示三个独立实验的SD。（F，G）RNAi处理线虫4天的糜蛋白酶样蛋白酶体活性。所示为相关活动（G）。误差条表示三个独立实验的SD。（H，I）20Sα亚基RNAi处理动物的相对蛋白质水平。（一）误差条表示三个独立实验的SD。（J、K）siRNA处理的HEK293细胞的糜蛋白酶样蛋白酶体活性。描述了相关活动（K）误差条表示三个独立实验的SD。（长、中）siRNA HEK293细胞20Sα亚基的相对蛋白水平。（百万）误差条表示至少六个独立实验的SD。（N，O）测定了4天、6天、8天和10天龄线虫的20Sα-亚基水平，并将其归一化为4天龄动物（O）。误差条表示五个独立实验的SD。（P）RNAi处理动物第4、6、8和10天的20Sα亚基。描述了至少三个独立实验中相对20Sα亚基水平的平均值。
图4
图4
伴侣蛋白的耗竭会促进细胞溶质应激、蛋白质错误折叠，并与诱导自噬和泛素-蛋白酶体系统（UPS）容量降低有关。（A、B）对siRNA处理的表达FlucDM-GFP的HEK293细胞进行活细胞成像。描述了siRNA转染后48小时的典型图像（A）作为对照，用20μM MG-132处理细胞6 h（B）红色三角形表示FlucDM-GFP聚集。比例尺：10μm。（C）在0、8、24和48小时采集的图像的聚合分析（A、B）。绿色表示无聚集细胞或少量聚集细胞，中间数量的聚集细胞用黄色表示，红色表示大量聚集细胞。（D、E）siRNA转染后24小时和48小时的FlucDM-GFP活性。伴侣基因敲除条件和相应时间点的相对荧光素酶活性（A）作为对照，用20μM MG-132处理细胞6 h（E）。误差条表示三个独立实验的SD。（F）siRNA处理的HEK293细胞的LC3-II水平。所示为标准化LC3-II水平。（G）siRNA处理的HEK293细胞的UbG76V-GFP水平。（H）siRNA处理的HEK293细胞的糜蛋白酶样蛋白酶体活性。
图5
图5
神经退行性疾病自噬受损秀丽线虫模型。（A）GFP:：LGG-1，GFP:；LGG-1；毫安β3–42和GFP:：LGG-1；百万立方米40：：第5天的RFP动物。下部面板是头部区域的放大图。比例尺：50μm（上部）和5μm（下部面板）。（B、C）GFP:：LGG-1对照水平，Aβ3–42和Q40动物在第5天。显示了GFP:：LGG-1的相对强度（C）误差条表示四个独立实验的标准偏差。（D）GFP:：LGG-1，GFP:；LGG-1；毫安β3–42和GFP:：LGG-1；平方米40：：第4天（左侧面板）和第10天（右侧面板）的RFP动物。上、中、下面板分别显示了整个动物、头部和头部区域的放大图。比例尺：20μm（上部）、50μm（中部）和5μm（下部面板）。（E、F）LGG-1和SQST-1/p62控制水平，mAβ3–42，nAβ3–42，平方米40：：RFP和nQ40：：YFP第4天和10条老线虫。标准化LGG-1和SQST-1/p62水平。误差条表示至少三个独立实验的SD。（G）对照组LysoTracker染色，mAβ3–42，nAβ1–42，平方米40：：RFP和nQ40：：YFP第4天动物。误差条表示每种情况下至少12只动物的SD。
图6
图6
淀粉样蛋白聚集体引起的蛋白质毒性应激与蛋白酶体损伤有关。（A、B）对照的糜蛋白酶样蛋白酶体活性，nAβ1–42和mAβ3–42第4天动物。描述的是相关活动（B）误差条表示三个独立实验的标准偏差。（C、D）对照组20Sα-亚基水平，nAβ1–42和mAβ3–42第4天动物。描述的是相对20S级别（D）。误差条表示三个独立实验的SD。（E）UbG76V的代表性方案：：Dendra2和Aβ3–42杂交动物。当肌肉和神经元中存在Aβ聚集体时（左），测定肌肉细胞中UbG76V:：Dendra2的降解率；当肌肉和神经细胞中存在Aα聚集体时，测定神经元细胞中Ub G76V：：Dendra 2的降解速率（右）。骨料显示为红色星形。（F、G）指示疾病模型中的UbG76V:：Dendra2降解率。转化的UbG76V:：Dendra2蛋白立即成像，3（G）或24（F）h后如图3B，C所示。误差条表示至少11只动物的SD。（H，I）对照组和mQ的糜蛋白酶样蛋白酶体活性40：：YFP第4天动物。描述的是规范化活动（一）。误差条表示三个独立实验的SD。（J，K）对照组和mQ的20Sα-亚基水平40：：YFP第4天动物。描述的是标准化的20S级别（K）。误差条表示三个独立实验的SD。（长、中）模型：HSP70/110/J分解伴侣的缺失导致错误折叠蛋白的增加，这与诱导自噬和幼年动物和HEK293细胞的蛋白酶体功能受损有关（左）.随着年龄的增长秀丽线虫，自噬不被激活，UPS活性不再因伴侣丢失而降低。肌肉和神经元中存在淀粉样蛋白聚集体时，自噬和蛋白酶体途径受到干扰秀丽线虫 （百万）.
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