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.2019年2月13日；9(1):1992.
doi:10.1038/s41598-018-38232-9。

免疫荧光层析成像：通过连续切片对甲基丙烯酸酯包埋组织进行高分辨率三维重建，并对齐二维免疫荧光图像

杰兰特·帕菲特 1 2
附属公司

免疫荧光层析成像：通过甲基丙烯酸酯嵌入组织的连续切片和二维免疫荧光图像的比对进行高分辨率三维重建

杰兰特·帕菲特. 科学代表. .

摘要

免疫荧光层析成像是一种基于甲基丙烯酸嵌入和连续切片的高分辨率三维重建方法，其中免疫染色连续切片的二维图像通过计算对齐到图像堆栈中，并渲染三维体。采用甲基丙烯酸丁酯（BMMA）塑料是因为它保留了极好的组织形态，并且可以使用有机溶剂轻松地进行脱塑，从而能够对连续切片进行免疫染色，而不会在毫米的三维重建组织（Z深度）上出现抗体穿透问题。通过以2µm的厚度切割连续截面，实现了大体积上的高轴向Z分辨率。染色切片通过多种方式成像，包括免疫荧光、电子显微镜和二次谐波产生（SHG），与共焦显微镜相比具有优势，因为组织不需要清除，而抗体渗透或光散射问题最小化。使用低pH甘氨酸盐酸盐抗体洗脱，可以在不损失组织结构的情况下重新探测塑料序列切片。这是一种具有成本效益的方法，因为所需的显微镜比共焦显微镜便宜得多，而且切片可以无限期保存。因此，免疫荧光断层扫描是一种利用抗体荧光在高分辨率3D中量化细胞亚群的强大新工具。本文介绍了乳腺、角膜和毛囊等上皮组织三维重建的免疫荧光断层成像方法。

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数字

图1
图1
BMMA塑料切片可以使用多种成像方式（如非线性光学）进行免疫标记和成像。(A类)组织学染色苏木精和伊红可用于勾勒基本细胞和组织结构，如眼睑的肌肉和毛囊。(B类)蛋白质（角蛋白1–红色）的免疫荧光染色和胶原纤维（白色）的二次谐波成像可以探测蛋白质表达和细胞外基质结构，通过DAPI染色（蓝色）确定细胞核分布。(C类)对内源性表达的荧光蛋白（如H2B-GFP/K5tTA小鼠中的组蛋白H2B-GFP融合蛋白）进行成像，以进行GFP的荧光强度分析，并与抗体染色蛋白（如角蛋白5（红色））共同定位。(D类)BMMA塑料型材切割为100 nm与重金属染色（乙酸铀酰和磷钨酸）进行对比，并使用JOEL 1010透射电子显微镜进行成像。分化的睑板腺细胞正在进行脂肪生成和全分泌，很容易看到。(E类)钙化小鼠股骨BMMA切片的暗场显微照片。（比例尺：A–C 100 µm；第2天 µm；E 100 微米）。
图2
图2
2的顺序免疫训练 小鼠眼睑的µm BMMA切片。(A类)角蛋白5（红色）在皮肤和结膜的基底上皮中表达，而Pparγ（绿色）定位于正在进行脂肪生成和全分泌的分化细胞。(B类)在55℃下使用甘氨酸盐酸盐（pH2.5）洗脱抗体后 °C，对同一切片进行角蛋白6（红色）和Ki67（绿色）染色，分别标记结膜细胞和活跃分裂细胞。（比例尺 = 100 µm）。
图3
图3
免疫荧光断层扫描生成的上皮组织的高分辨率三维重建。(A类)角蛋白8染色的小鼠乳腺管腔层（红色）和α-SMA染色的基底层（绿色）。(B类)小鼠乳腺角蛋白8和α-SMA免疫染色的三维重建。(C类)小鼠角膜上皮、下层基质和内皮。(D类)使用上皮细胞（青色）和角膜细胞/内皮细胞（红色）的DAPI染色进行角膜三维重建。(E类)小鼠结肠角蛋白8（红色）和α-SMA（绿色）染色。(F类)小鼠结肠免疫荧光断层扫描三维重建，单个绒毛分段。（比例尺 = 100 µm）。
图4
图4
胚胎第15.5天发育中小鼠前肢的三维重建。(A类)角蛋白5免疫染色定位于浅表上皮。(B类)整个小鼠前肢的三维重建由533个连续切片（1066个）生成 µm z深度）在2处切割 µm，并使用20X/0.75NA物镜成像。
图5
图5
三维荧光强度梯度(A类)由于免疫荧光断层扫描提供了改进的轴向分辨率，因此可以可视化免疫染色蛋白和内源性表达荧光蛋白的荧光强度梯度。(B类)H2B-GFP/K5tTA小鼠毛囊中的标记阳性细胞根据其细胞周期率保留GFP标记，最静止的细胞是最强的标记阳性的细胞。(C类)通过增加荧光强度和标签保持力（绿色）对小鼠毛囊隆起室中的标签保持细胞进行三维重建 > 黄色的 > 红色）。(D类)小鼠毛囊免疫荧光断层扫描三维重建，根据荧光强度显示SOX9表达和标记细胞。（比例尺 = 100 µm）。
图6
图6
免疫荧光断层扫描法。(A类和B类)组织固定在2%多聚甲醛中，脱水和树脂渗透后在紫外光下嵌入甲基丙烯酸丁酯塑料（BMMA）中。(C类)BMMA包埋组织于2时连续切片 使用带超切片机的金刚石刀，厚度为µm。(D类)连续切片进行免疫染色，并使用徕卡DMI6000B荧光显微镜获取图像。(E类)在用新抗体重新保护抗体之前，使用低pH甘氨酸盐酸盐洗脱抗体。(F类和G公司)使用Amira软件对连续切片图像进行对齐，用于三维重建、细胞亚群的量化和感兴趣区域的分割。
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