跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2019年2月13日；2（1）：e201800276。
doi:10.26508/lsa.201800276。 打印2019年2月。

3D基质中的上皮极化需要DDR1信号调节肌动球蛋白收缩性

Pia Pernille Søgaard女士 1, 伊藤诺里科 1, 佐藤Nanami 2, 藤田康树 2, 卡尔·马特 三, 伊藤义文 4
附属机构

3D基质中的上皮极化需要DDR1信号调节肌动球蛋白收缩性

皮亚·佩尼尔·瑟加德等。 生命科学联盟. .

摘要

上皮细胞在各种上皮器官中形成片状和小管，并建立顶端极性和不对称的小泡运输，以在这些结构中提供功能。然而，上皮细胞建立极性的分子机制尚不清楚。在此，我们提出证据表明，胶原受体酪氨酸激酶盘状结构域受体1（DDR1）的激酶活性是有效建立上皮极性、适当的不对称蛋白质分泌和执行形态形成程序所必需的。DDR1蛋白的缺乏或DDR1激酶活性的抑制扰乱了小管生成、膀胱生成和上皮极性的建立，并导致膜型1基质金属蛋白酶（MT1-MMP）、GP135、初级纤毛、层粘连蛋白和高尔基体的极化定位缺陷。DDR1抑制引起的上皮极性和膀胱生成受到过度ROCK（rho-associated，coiled-coil-containing protein kinase）驱动的肌动球蛋白收缩力的影响，ROCK的药物抑制足以纠正这些缺陷。我们的数据表明，DDR1-ROCK信号轴对于有效建立上皮极性至关重要。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人声明他们没有利益冲突。

数字

图1。
图1.HGF诱导极化上皮细胞基底表面MT1-MMP的I型胶原依赖性功能显著增加。
（A）左图：MT1F-phfluorin-RFP构造的表示。右图：将稳定表达MT1F-phfluorin-RFP的MDCK细胞接种在3D胶原蛋白I（2 mg/ml）中，并在无HGF的情况下培养48小时（对照）。然后在HGF（50 ng/ml）（HGF）存在下继续培养20 h。用共焦显微镜对细胞进行成像，以检测pHfluorin（绿色）和RFP1（红色）。箭头指向基底细胞膜上的MT1-MMP。显示了具有代表性的图像。（B）将MDCK细胞接种在胶原I原纤维、明胶或塑料上。在存在GM6001（10μM）的情况下，以5倍的MOI用Ad-MT1F感染细胞。24小时后，清洗GM6001，并在有或无HGF（50 ng/ml）的条件下再培养细胞24小时。表面MT1F在冰上活细胞中染色，并通过共焦显微镜成像。MT1F显示为绿色，肌动蛋白显示为红色。显示了顶部和底部表面的共聚焦切片。注意，当细胞在I型胶原上培养时，在HGF处理后可以观察到MT1F的基础定位。（C）通过测量每个条件下10个共聚焦堆栈中相同体积的488-nm通道在顶面和底面的强度，对B的结果进行量化。根据代表肌动蛋白的通道中的信号选择体积。根据材料和方法一节中的描述，计算基底表面总MT1F的百分比。数据绘制为平均值±SD。测试条件与Kruskal–Wallis秩和检验进行比较(P（P）< 2 × 10−16)在使用两两Wilcoxon检验和Bonferroni–Holm对P（P）-值以更正多次测试。星号表示统计上的显著差异(*P（P）< 0.05). 第I列：胶原蛋白I。
图S1。
图S1..MT1F-phfluorin在稳定转染的MDCK细胞中的表达。
对稳定表达空质粒（Mock）、MT1-pHfluorin-RFP和MT1F-RFP的MDCK细胞进行MT1-MMP和肌动蛋白的Western blotting。
图2。
图2：DDR1激酶是肾小管生成和基底表面极性依赖性MT1-MMP定位所必需的。
（A）将稳定表达非靶标shRNA（siNT）或DDR1 shRNA（siDDR1）的MDCK细胞在含有HGF（50 ng/ml）的三维I型胶原凝胶中培养5 d。然后对细胞进行明亮视野成像和/或对GP135（绿色）、F-actin（红色）和细胞核（DAPI/蓝色）进行间接免疫荧光成像。插图显示方框区域的放大图像。（B）对稳定转染空质粒（Mock）或细胞质结构域缺失的DDR1（DDR1∆C）的MDCK细胞进行管生成测定，并作为（A）的细胞进行分析和成像。（C）MDCK细胞在DMSO载体（对照）或DDR1-in-1（1μM）存在下进行小管生成试验。对细胞进行分析并成像为（A）的细胞。（D）在DMSO载体（对照）或DDR1-in-1（1μM）存在下对MDCK细胞进行小管生成试验，并通过乙酰化微管蛋白（绿色，左侧）、层粘连蛋白（绿色、右侧）和F-actin（红色，左侧和右侧）的间接免疫荧光成像，如图所示。（E）将稳定表达空质粒（Mock）、DDR1和DDR∆C的MDCK细胞培养在涂有明胶的微载体小球上，直至汇合。然后将珠状物嵌入含有或不含HGF和/或DDR1-in-1（1μM）的胶原蛋白凝胶中，如图所示。72小时后拍摄到亮场图像。3个以上独立实验中的1个实验显示了典型图像。箭头指向生成的管状结构。箭头指向与珠子接触的细胞和细胞附加外层之间形成的管腔。在右上图中，显示了使用ImageJ软件测量的每种条件下五种不同结构的10个最长突出物长度的量化。数据绘制为平均值±SE。Kruskal检验显示各组的分布存在显著差异(P（P）< 2.2 × 10−16)采用配对Wilcoxon检验和Bonferroni–Holm的多重检验校正来确定差异。星号表示统计上的显著差异(***P（P）< 0.001). 下图显示了结构面积的量化：使用ImageJ软件测量了每个条件下5-7个结构的面积。为了校正珠子大小的差异，从而在起点处校正不同数量的细胞，将每个结构的面积归一化为珠子的面积。数据绘制为平均值±SE。Kruskal检验显示各组的分布存在显著差异(P（P）=0.0004），并通过配对Wilcoxon检验和多重检验的Holm校正确定差异。星号表示统计上的显著差异(*P（P）< 0.05).（F）对来自（D）的细胞进行GP135（绿色）、肌动蛋白（红色）和细胞核（DAPI，蓝色）的间接免疫荧光染色。箭头指向心尖腔。注意，表达DDR1∆C的细胞不会形成管腔，也不会干扰GP135定位。（G）MCF10A细胞在DMSO（对照）或1μM DDR1-in-1存在下培养7天。凝胶固定并成像以获得明亮的视野，或进行F-actin（红色）和DAPI（蓝色）染色，并通过共焦显微镜进行分析。（H）将MDCK细胞接种在含有DDR1-in-1（1μM）的I型胶原纤维、塑料或明胶膜上24 h。然后用Ad-MT1F转导细胞24 h，并在含有或不含有HGF（50 ng/ml）的情况下用DDR1-in-1进一步培养16 h。%基底表面的局部MT1-MMP分析如图1C所示。显示了具有代表性的横截面。数据绘制为平均值±标准差。（一）MDCK细胞在有无HGF和/或DDR1-in-1的情况下进行胶原膜降解试验。消化面积被量化并显示在图表中（n=4）。
图S2。
图S2.DDR1敲除/过度表达的确认以及DDR1-IN-1对胶原蛋白诱导的DDR1磷酸化的影响。
（A）从稳定表达NT-shRNA或DDR1-shRNA的MDCK细胞克隆系制备裂解物，并使用针对DDR1或肌动蛋白胞质结构域的一级抗体进行Western blot分析。（B）使用针对DDR1细胞质域（识别内源性和过度表达的DDR1，但由于缺乏细胞质域，不能识别DDR1∆C）、DDR1外域（仅识别外源性表达的DDR1）和肌动蛋白的一级抗体，通过Western blot分析MDCK-Mock、MDCK-DDR1和MDCK-DDR∆C细胞的裂解产物。（C）在DMSO或DDR1-in-1存在下接种MDCK细胞，并隔夜饥饿血清。用或不使用I型胶原（100μg/ml）刺激细胞4 h。从细胞裂解物中免疫沉淀DDR1，并通过Western blotting分析DDR1和磷酸酪氨酸。对免疫沉淀的输入样本进行肌动蛋白分析。
图S3。
图S3.珠状小管生成试验总结。
（A）当培养在明胶珠上的MDCK细胞嵌入三维胶原基质中时，细胞垂直增殖，形成额外的极化细胞层。两层细胞之间的空间是腔，面对腔的质膜是顶面。（B）在HGF刺激下，外细胞层经历形态发生程序。尖端细胞形成，开始随附细胞侵入，小管结构向基底胶原基质延伸。（C）当细胞过度表达DDR1时，它们形成类似于（a）的无HGF双层结构。（D）在HGF治疗后，外层的所有细胞都开始侵入胶原基质，形成一个具有大腔的扩大囊肿。（E）当DDR1激酶活性受到抑制时，珠子上的细胞没有形成极化双层结构，而是形成细胞聚集。无论胶原蛋白或明胶附着如何，顶端和基底标记都在聚集体内扩散。（F）HGF处理后，细胞增殖并形成较大的聚集物，但上皮极性仍完全丧失。红色高亮表示基础标记，绿色高亮表示顶部标记的位置。
图S4。
图S4.DDR1抑制干扰MT1-MMP定位的调节。
将稳定表达MT1F-phfluorin-RFP的MDCK细胞接种在I型胶原纤维、明胶或塑料上。24小时后，加入HGF，继续培养24小时，然后通过共焦显微镜捕获线扫描图像。显示了每个条件下的代表性图像；绿色为pHfluorin，红色为RFP。该图表示基底表面MT-MMP百分比的平均值±SD。将测试条件与Kruskal–Wallis秩和检验进行比较(P（P）=0.005731），然后使用配对Wilcoxon检验和Holm校正P（P）-值。星号表示统计上的显著差异(**P（P）< 0.05; ***P（P）<0.01）。
图3。
图3抑制DDR1可防止3D极化囊肿的形成。
（A）左图和中图：MDCK细胞在含有DMSO（对照）或1μM DDR1-in-1的3D胶原凝胶中生长7 d，并对F-actin（灰色）、GP135（绿色）和层粘连蛋白（红色）进行间接荧光成像。右图：细胞也被乙酰化微管蛋白（绿色）和GM130（红色）染色。箭头指向囊肿腔，而箭头指向DDR1-in-1存在时GP135的基底染色。（B）CaCO-2细胞在2%Matrigel中在DMSO（对照）或DDR-in-1（1μM）存在下培养9天。左：细胞染色为ZO-1（绿色）和f-actin（红色）。右图：对细胞进行GM130（绿色）和f-actin（红色）染色。显示了具有代表性的图像。
图S5。
图S5.DDR1∆C的表达在膀胱发生过程中干扰了极性。
MDCK-Mock和MDCK-DDR1ΔC在3D I型胶原凝胶（2 mg/ml）中培养7 d。对细胞进行GP135（绿色）和细胞核（蓝色）（左侧面板）、乙酰化微管蛋白（绿色）、f-actin（红色）和细胞核。显示了具有代表性的图像。
图4。
图4：DDR1抑制导致根尖极性的建立延迟，以及根尖表面细胞-细胞连接处的ROCK依赖性ppMLC积聚。
（A）在存在或不存在DDR1-in-1（1μM）的情况下，将MDCK细胞在培养插入物中100%融合的I型胶原上培养4天，并对GP135（绿色）和F-肌动蛋白（红色）（顶部）、E-钙粘蛋白（绿色）和F-肌动蛋白（红色）（中间）进行间接免疫荧光染色；ZO-1（绿色）和F-actin（红色）（底部）。通过共焦显微镜拍摄图像。显示了具有代表性的XZ截面。（B）用DDR1-IN-1培养的MDCK细胞进行TER分析，如材料和方法一节所述。在添加钙后23、25.5、28、45、47.5、50和69小时进行TER测量。根据时间绘制了每种条件下三口井的平均TER值。误差条表示井之间的SD。（C）如图所示，在有或无DDR1-in-1（1μM）和/或Y27632（10μM）的情况下，将MDCK细胞以40%的汇合率接种在胶原膜上36小时。对细胞进行ppMLC（绿色）和F-actin（红色）染色。箭头指向对照（Cont）细胞中常见的皮层肌动蛋白带和DDR1-in-1处理细胞中的ppMLC阳性应力纤维。通过计算和绘制沿着细胞-细胞接触带ppMLC阳性肌动蛋白束的细胞百分比来分析图像。对两个独立实验中每种条件下的122–262个细胞进行了分析。（D）如图所示，MDCK细胞在含有二甲基亚砜或DDR1-in-1（1μM）的情况下，在涂有I型胶原的培养基中100%融合培养。将细胞固定，并对ppMLC（绿色）和ZO-1（红色）进行染色。箭头指向连接点ppMLC。（E）上述培养的MDCK细胞用ppMLC（绿色）和肌动蛋白染色，并在共焦显微镜下成像。顶部：显示ppMLC（绿色）和actin（红色）的代表性XZ截面。比例尺，10μm。底部：在ImageJ中测量的每个共焦部分的平均强度，并归一化为该堆栈中的最高平均强度。根据最顶端截面和每个Z截面的平均值对齐叠加，计算并绘制误差条，误差条代表平均值的标准误差。分析了从四个独立实验中收集的每种条件55–60个堆栈。（A） 顶端，（B）基部。（F）MDCK-DDR1细胞在I型胶原涂层的培养插入物中培养汇合36 h。细胞染色：F-actin（灰色）、DDR1（红色）和E-cadherin（绿色）。通过共聚焦显微镜分析样品，并显示XY和XZ平面的代表性图像。（A） 顶端，（B）基部。
图S6。
图S6.DDR1抑制不会阻止2D培养中根尖极性的建立，但会延迟成熟/极化过程。
（A）MDCK-Mock和MDCK-DDR1∆C细胞在涂有I型胶原（1.5 mg/ml）的培养基中100%融合培养，然后用GP135（绿色）/actin（红色）（顶部）或ZO-1（绿色）/actin（红）（底部）染色。样品为共焦显微镜。显示了具有代表性的XZ截面。（B）MDCK细胞接种在低钙的无涂层培养基中2+介质中含有DMSO（对照）或DDR1-in-1（1μM）。第二天早上，培养基换成了Ca2+-包含有或没有DDR1-IN-1的介质，如图所示。TER测量在培养15分钟后开始，并在Ca后20.5至25.5小时之间每小时进行一次2+开关。根据时间绘制了每种条件下三口井的平均TER值。误差条表示井之间的SD。
图S7。
图S7..DDR1抑制增加了接种在玻璃上的细胞的ROCK活性。
（A）如图所示，在有或无DDR1-in-1（1μM）和/或Y27632（10μM）的情况下，将MDCK细胞以40%的汇合率接种在玻璃盖玻片上，持续36 h。对细胞进行ppMLC（Thr18/Ser19）（绿色）和F-actin（红色）染色。样品用20×物镜的宽视野显微镜进行分析。箭头指向对照细胞中常见的皮层肌动蛋白带和DDR1-in-1处理细胞中的ppMLC-阳性应力纤维。图像分析了沿着细胞-细胞接触带ppMLC阳性肌动蛋白束的细胞百分比。对两个独立实验中每种条件下的48–78个细胞进行了分析。（B）将稳定表达DDR1的MDCK细胞在I型胶原涂层（1.5 mg/ml）培养基中100%融合培养36 h。对细胞进行F-actin（白色）、DDR1（细胞质域，红色）和ZO-1（绿色）染色。通过共聚焦显微镜分析样品，并显示代表性的XY和XZ平面。（A） 顶端，（B）基部。请注意，DDR1与ZO-1共存。
图5。
图5：在缺乏DDR1信号的情况下，抑制ROCK活性可挽救极化囊肿的形成。
（A）MDCK细胞在3D胶原蛋白凝胶中培养5 d，其中有或没有DDR1-in-1（1μM）、Y27632（10μM）和/或H1152（4μM）。细胞固定并染色GP135（绿色）和F-actin（红色）。样品通过共焦显微镜进行分析。（B）在DDR1-in-1（1μM）和/或布利司他丁（25μM）存在下，将细胞培养为（A）中的细胞。亮场图像由宽场显微镜捕获。箭头指向内腔。（C）从每次治疗中统计具有单层腔的囊肿的数量，并显示囊肿在总结构中的百分比（灰色）。本分析中包含的结构总数为460（对照）、432（DDR1-in-1）、771（DDR1-in-1+Y27632）、250（DDR1-in-1+H1152）、231（Y27632）、142（H1152）和134（DDR-in-1+blebbistatin）。
图6。
图6。DDR1在经历分支形态发生的初级上皮细胞中起着内在作用，并且是体内正确组织基底膜所必需的。
（A）左：从野生型和DDR1阴性雌性C57Bl/6J小鼠的第四对乳腺在产后3天被解剖并固定在福尔马林中。所有小鼠均为13-14周龄。将组织包埋在石蜡中并进行HE染色。显示了野生型（+/+）和DDR1-null（−/−）小鼠的代表性组织切片。比例尺代表200μm。右：使用ImageJ测量乳腺肺泡面积。对三组野生型（+/+）和DDR1-null（−/−）小鼠同窝对测定了每只小鼠99–196个肺泡的平均面积。小鼠的相对肺泡面积以条形图的形式绘制，用于每对同窝鼠。数据被绘制为平均值±SE，并通过t吨测试。星号表示统计上的显著差异(***P（P）< 0.0001).（B、C）对三只野生型和三只DDR1阴性小鼠的组织切片进行IHC以检测IV型胶原（B）或层粘连蛋白（C）。切片用苏木精复染。显示了具有代表性的图像。（D）从12至13周龄的两只野生型雌性C57Bl/6J小鼠上解剖第二、第三和第四对乳腺，并进行材料和方法部分所述的形态发生分析。左图：显示了典型的亮场图像。右图：统计了具有三个以上分支的经历分支形态发生的类有机物的百分比。三个独立实验的平均百分比绘制在条形图中，误差条代表SD。
图7。
图7 ROCK救援的抑制减弱了乳腺的形成，并通过抑制DDR1信号诱导β-酪蛋白表达。
（A）按照材料和方法部分所述，对HC11细胞进行致乳分化试验。显示了三个独立实验之一的在正常生长培养基（对照）和分化培养基（DIP）中培养的细胞的代表性图像。红色箭头表示分化时形成的乳细胞。（B）分化后的HC11细胞进行F-actin（绿色）和DAPI（蓝色）染色，并用共焦显微镜进行分析。显示了来自一个实验的代表性XY、XZ和YZ截面。（C）从（A）开始，在有无DDR1-in-1和/或H1152的情况下培养HC11，并在添加DIP培养基后的第4天，通过计算每种情况下每个区域（每种情况10–30个区域）的平均乳房球数来量化分化。图表表示三个独立实验的平均值±SD，以及由t吨测试。星号表示统计上的显著差异(***P（P）< 0.001).（D）从（C）开始培养HC11细胞。添加DIP培养基后5天，在冈田酸存在下对细胞进行裂解。用抗ppMLC、MLC和肌动蛋白的一级抗体对裂解产物进行Western blot。显示了具有代表性的污点。使用ImageJ分析ppMLC和MLC的谱带强度，每个处理的ppMLC与MLC之间的归一化比率如下图所示。将数据绘制为五个独立实验数据的平均值±SD，并通过t吨测试。星号表示统计上的显著差异(*P（P）<0.03**P（P）< 0.015).（E）细胞培养为（C）和（D）细胞。在DIP刺激5d后提取总RNA，并用RT-PCR评估β-酪蛋白和GADPH mRNA的数量。此图的源数据可用。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

工具书类

    1. Akhtar N，Streuli CH（2013）整合素-ILK微管网络引导腺上皮细胞极性和管腔形成。《自然细胞生物学》15:17–27。10.1038/ncb2646-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Ball RK、Fries RR、Schoenenberger CA、Doppler W、Groner B（1988），催乳素对克隆小鼠乳腺上皮细胞系中β-酪蛋白基因表达和胞浆120-kd蛋白的调节。EMBO J 7:2089–2095。10.1002/j.1460-2075.1988.tb03048.x-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Barr FA，Egerer J（2005）Golgi定位：我们正在寻找正确的MAP吗？细胞生物学杂志168:993–998。10.1083/jcb.200501088-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Bryant DM、Roignot J、Datta A、Overeem AW、Kim M、Yu W、Peng X、Eastburn DJ、Ewald AJ、Werb Z等（2014）上皮细胞极化方向的分子开关。Dev Cell公司31:171–187。2016年10月10日/j.devcel.2014.08.027-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Carafoli F，Hohenester E（2013），盘状素域受体对胶原蛋白的识别和跨膜信号传递。《生物化学与生物物理学学报》1834:2187-2194。2016年10月10日/j.bbapap.2012.10.014-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型