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.2019年2月13日；10(1):53.
doi:10.1186/s13287-019-1157-5。

血管生态位在成人肝细胞转分化产生的胰岛素分泌细胞中的作用

伊里特·梅瓦尔·勒维 1 2, 法蒂玛·佐比 三 4, 吉尔·纳迪尼 5, 尤金妮娅·曼尼维兹·曼德尔森 6, 吉尔·斯莱奇纳 6, 奥兰特·扎多克 三, 迈克尔·古雷维奇 7, 伊坦·莫尔 7, 西蒙娜·迪马 8 9 10, 伊里内尔·波佩斯库 8 9 10, 阿维夫·巴齐莱 4 6, 莎拉·费伯 三 8 4, Shoshana Greenberger公司 4 6
附属公司

血管生态位在成人肝细胞转分化产生的胰岛素分泌细胞中的作用

伊里特·梅瓦尔·勒维等。 干细胞研究与治疗. .

摘要

背景：胰岛素依赖性糖尿病是一种多因素疾病，理论上可以通过功能性胰岛和胰岛素产生细胞（IPC）植入来治愈。再生医学方法包括在实验室中生长组织和器官，并在身体无法自行愈合时将其移植。然而，为了使糖尿病再生医学方法更接近临床实施，仍有一些障碍需要克服；体外生成的细胞具有典型的异质性和未成熟性，植入部位应易于血管化，以便植入细胞在体内存活。本研究通过分析IPC与促血管细胞在可接近部位（如皮下）共同植入的效果来解决这两个局限性。其次，分析了体外重建体内环境对胰岛素生成细胞成熟和功能的影响。

方法：由人肝细胞转分化产生的IPC受到内皮细胞集落形成细胞（ECFCs）和人骨髓间充质干细胞（MSCs）的旁分泌作用，而这些细胞是血管的“构建块”。在免疫缺陷啮齿动物体内皮下植入后，分析血管系统对IPC功能的作用。在培养中分析了血管系统对IPC成熟的旁分泌作用。

结果：MSCs和ECFCs与IPCs的联合移植导致体内存活率加倍，胰岛素生成量增加三倍。与单独IPCs相比，ECFC和MSC共培养以及共培养条件培养基导致胰腺特异性基因的表达显著增加，葡萄糖调节胰岛素分泌增加。从机制上讲，我们证明ECFC和MSC共培养增加了CTGF和ACTIVINβα的表达，这在胰腺分化中起着关键作用。

结论：血管系统是产生糖尿病再生医学方法的重要因素。血管系统对胰岛素分泌细胞的成熟及其在植入后的存活表现出旁分泌作用。体内生态位的重建有望促进肝-胰腺转分化，并使这种细胞治疗方法更接近临床实施。

关键词：骨髓间充质干细胞；内皮细胞集落形成细胞；胰岛素生成细胞；胰腺转录因子；转分化；血管系统。

PubMed免责声明

利益冲突声明

道德批准和参与同意

经Sheba医学中心临床调查委员会（机构审查委员会）批准，使用肝组织。所有肝脏样本捐赠者或代表未成年人的监护人提供书面知情同意书，以收集所有样本并进行后续分析。没有从被处决的囚犯或其他被收容的人那里获得捐献器官。

动物程序由Sheba医疗中心动物护理和使用机构委员会批准。

出版同意书

不适用

竞争性利益

SF是Orgenise的员工和顾问。IML是Orgenise的一名员工。其他作者声明，他们没有相互竞争的利益。

出版商备注

Springer Nature在公布的地图和机构关联中的管辖权主张方面保持中立。

数字

图1
图1
MSCs、ECFC和IPCs的联合移植促进了体内植入物的血管化。将混合有Matrigel的细胞植入SCID-米色小鼠皮下，每只小鼠植入四个含有IPCs/ECFCs/MSCs（1/1/1）的植入物(n个 = 8） 或仅控制IPC植入(n个 = 6） 如所示一.b条植入后4至8周取回植入物。c（c）植入物用H&E和抗人CD31染色。显示典型植入物的面板。比例尺，50 微米。d日通过计数CD31阳性血管来评估微血管密度（MVD）。每个实验条件下报告的值对应于平均MVD值±平均值的标准误差（SEM）n个 > 4和8的6个 周
图2
图2
人体微血管促进体内IPC的存活和功能。一植入物在4天后取出 植入周后用抗HLA染色(一，上部面板）和抗人胰岛素(一（下面板）。b条HLA阳性细胞的定量是通过随机五倍计数细胞来完成的 每个植入物40个场。每个实验条件的报告值对应于平均细胞数 ± 平均值标准误差（SEM）n个 > 6代表4和8 周*P（P）价值< 0.05.c（c）对IPC/ECFC/MSC植入物进行胰岛素（绿色）和胰高血糖素（红色）双重染色。d日在植入后2周、4周和8周测量葡萄糖刺激后的血清人类c肽。每组3至8只小鼠在每个时间点的结果为平均值和标准误差（SE）*P（P）价值< 0.05
图3
图3
在Transwell®系统中ECFC和MSC共同培养可促进pTF诱导的体外肝胰腺转分化。诱导的IPC培养在Transwell®的底部；插入物镀有ECFC或MSC或ECFC+MSC（1:1比率）或IPC作为对照，如一。3天后，测量细胞的转分化效率，如b条：胰腺特异性基因的转录水平以平均值和SE表示，表示仅用pTF处理的上述细胞的增加，在常规的12孔/板（TC板）中培养并标准化为β-肌动蛋白级别*P（P）价值< 0.05和**P（P）价值< 分别为0.01。c（c）使用特定的人类放射免疫试剂盒（DPC）测量葡萄糖调节胰岛素分泌。将在Transwell®系统中培养的细胞分泌物与在常规12孔/板（TC板）上培养的细胞进行比较。结果显示为平均值和SE，n个 ≥ 12来自不同供体的四个独立重复*P（P）价值< 与仅用pTFs处理、在常规TC板处理中培养的细胞相比，0.01。图下方的标签表示Transwell®系统插入物中培养的细胞类型
图4
图4
ECFC和MSC共培养可促进特定生长因子的表达。MSCs和ECFC分别培养或以1:1的比例共同培养。五天后，来自共培养物的细胞被免疫分离。CD31型(一),细胞生长因子(b条)、和活动-A(c（c）)对转录水平进行分析。结果标准化为GAPDH公司基因表达。结果显示为平均值和SE，n个 = 两个独立重复，一式三份*P（P）价值< 与作为阴性对照的人皮肤成纤维细胞相比，0.01
图5
图5
条件培养基在TD过程中促进胰腺分化。48天后收集条件培养基 h共培养ECFC和MSCs（1:1比例）。将培养基加入正在经历转分化的肝细胞中，无论是新鲜还是加热至56 °C（与TD介质的比例为1:1），如所示一.b条对IPC进行葡萄糖调节胰岛素分泌分析。使用特定的人类放射免疫试剂盒（DPC）分析胰岛素水平，并与TD培养基（新鲜或加热）中培养的细胞进行比较。结果显示为TD培养基中低血糖时分泌增加的平均值和SE，n个 ≥ 8来自不同供体的三个独立重复*P（P）价值< 与对照组相比0.01(c（c）–e（电子）). 在TD过程的第1天或第3天添加条件培养基（与TD培养基的比例为1:1），并通过特异性胰腺基因表达分析胰腺表型(c（c）,d日)和葡萄糖诱导的胰岛素分泌(e（电子）). 所示基因的转录水平以平均值和SE表示，表示上述细胞仅用pTFs处理后的增加，并归一化为β-肌动蛋白水平。N个 = 不同供体中有3-4个独立重复*P（P）价值< 0.01和**P（P）价值< 与对照组相比，0.05。使用特定的人类ELISA试剂盒（ALPCO）分析胰岛素水平，并与TD培养基中培养的细胞进行比较。结果显示为平均值，SE标准化为单元数，n个 ≥ 8来自三个不同的实验*P（P） < 0.01和**P（P） < 与对照组相比0.05
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