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.2019年1月1日；15(2):325-340.
doi:10.7150/ijbs.29009。 2019年eCollection。

二甲双胍通过AMPK-mTOR-TFEB信号通路诱导自噬促进随机模式皮瓣存活

吴洪强 1 2 3, 建鼎 1 2 3, 李世亨 1 2 3, 金体林 1 2 3, 姜仁浩 1 2 3, 陈琳 1 2 3, 李岱 1 2 3, 谢成龙 1 2 3, 林定生 1 2 3, 徐华子 1 2 3, 魏阳高 1 2 3, 周开良 1 2 3
附属公司

二甲双胍通过AMPK-mTOR-TFEB信号通路诱导自噬促进随机模式皮瓣存活

吴洪强等。 国际生物科学杂志. .

摘要

随机图案皮瓣广泛用于修复和整形手术中的缺损；然而，它们很容易坏死，尤其是在皮瓣的远端。在这里，我们研究了二甲双胍对皮瓣存活的影响以及这些影响的潜在机制。二甲双胍治疗后，术后第7天皮瓣的存活面积、血流量和微血管数量增加，而组织水肿减少。此外，二甲双胍促进血管生成，抑制凋亡，减轻氧化应激，增加缺血区域的自噬；这些作用被自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3MA）或氯喹（CQ）逆转。3MA或CQ均能逆转二甲双胍诱导的皮瓣存活率增加。此外，二甲双胍还激活了缺血区域的AMPK-mTOR TFEB信号通路。通过化合物C（CC）或AMPK shRNA腺相关病毒（AAV）载体抑制AMPK，导致二甲双胍治疗皮瓣中AMPK-mTOR-TFEB信号通路和自噬水平下调。综上所述，我们的研究结果表明，二甲双胍通过增强血管生成、抑制凋亡和氧化应激，提高了随意型皮瓣的存活率。这些效应是由于AMPK-mTOR-TFEB信号通路激活介导的自噬增加所致。

关键词：AMPK-mTOR-TFEB信号通路；自噬；二甲双胍；随机图案皮瓣。

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竞争利益：作者声明不存在竞争利益。

数字

图1
图1
MET提高了随机皮瓣的生存能力。（A）POD 3和POD 7上对照组和MET组皮瓣的数字照片（比例尺，1 cm）。（B）对对照组和MET组的生存面积百分比进行量化和分析。（C）POD7上对照组和MET组皮瓣内侧的数字照片（比例尺，1 cm）。（D）各组组织含水量百分比直方图。（E）POD 7上各组皮瓣的全场LDBF图像（比例尺，1 cm）。（F）定量分析皮瓣血流信号强度。（G）H&E染色显示对照组和MET组皮瓣II区的血管（原始放大×200；比例尺，50μm）。（H）每组MVD百分比直方图。（一）CD34的IHC显示对照组和MET组II区的血管（原始磁感应强度×200；比例尺，50μm）。（J）各组CD34阳性血管百分比直方图。数值表示为平均值±SEM，每组n=6*第页<0.05和**第页<0.01，与对照组相比。
图2
图2
MET促进随意皮瓣的血管生成。（A&C）对照组和MET组缺血皮瓣中VEGF和Cadherin 5表达的IHC（原始放大倍数×200；比例尺，50μm）。（B&D）对各组VEGF和Cadherin 5的光密度值进行量化和分析。（E-G）Western blotting检测对照组和MET组缺血皮瓣中VEGF、MMP9和Cadherin 5的表达。凝胶在相同的实验条件下运行，这里使用的是裁剪过的斑点。（H-J）对各组VEGF、MMP9和Cadherin 5的光密度值进行量化和分析。数值显示为平均值±SEM，n个=每组6人*第页<0.05和**第页<0.01，与对照组相比。
图3
图3
MET可减少随机皮瓣中的细胞凋亡。（A）对照组和MET组缺血皮瓣中CASP3表达的IHC（原始放大倍数×200；比例尺，50μm）。（B）对各组CASP3的光密度值进行量化和分析。（中-英）Western blotting检测对照组和MET组缺血皮瓣中Bax、CYC和CASP3的表达。凝胶在相同的实验条件下运行，这里使用的是裁剪过的斑点。（F-H）对各组Bax、CYC和CASP3的光密度值进行量化和分析。数值表示为平均值±SEM，n个=每组6人*第页<0.05和**第页<0.01，与对照组相比。
图4
图4
MET抑制随意皮瓣中的氧化应激。（A）对照组和MET组缺血皮瓣中SOD1表达的IHC（原始放大倍数×200；比例尺，50μm）。（B）对各组SOD1的光密度值进行量化和分析。（中-英）Western blotting检测对照组和MET组缺血皮瓣中eNOS、SOD1和HO1的表达。凝胶在相同的实验条件下运行，这里使用的是裁剪过的斑点。（F-H）对各组eNOS、SOD1和HO1的光密度值进行量化和分析。数值以平均值±SEM表示，n个=每组6人**第页<0.01，与对照组相比。
图5
图5
MET激活随机皮瓣中的自噬。（A）通过LC3II免疫荧光染色（标尺，25μm），对照组和MET组皮瓣II区细胞中的自噬体（红色）。（B）对照组和MET组缺血皮瓣中CTSD表达的IHC（原始放大倍数×200；比例尺，50μm）。（C）对各组CTSD的光密度值进行量化和分析。（D和E）Western blotting检测对照组和MET组缺血皮瓣中Beclin1、LC3II、p62、VPS34和CTSD的表达。凝胶在相同的实验条件下运行，这里使用的是裁剪过的斑点。（F）对各组的Beclin1、LC3II、p62、VPS34和CTSD的光密度值进行量化和分析。数值表示为平均值±SEM，n个=每组6人*第页<0.05和**第页与对照组相比，<0.01。
图6
图6
抑制自噬可逆转MET对血管生成、凋亡和氧化应激的影响。（A）通过LC3II免疫荧光染色（标尺，25μm），MET组和MET+3MA组皮瓣II区细胞中的自噬体（红色）。（B&D）自噬相关蛋白VPS34、p62、LC3II、Beclin1和CTSD的表达；血管生成相关蛋白VEGF、Cadherin 5和MMP9；通过Western blotting检测各组氧化应激相关蛋白SOD1、HO1和eNOS以及凋亡相关蛋白Bax、CYC和CASP3。凝胶在相同的实验条件下运行，这里使用的是裁剪过的斑点。（C&E）两组VPS34、p62、LC3II、Beclin1、CTSD、VEGF、Cadherin 5、MMP9、SOD1、HO1、eNOS、Bax、CYC和CASP3表达的光密度值。数值表示为平均值±SEM，n个=每组6人。#第页<0.05和##第页<0.01，与MET组相比。
图7
图7
抑制自噬可逆转MET对皮瓣活力的影响。（A）POD 3和POD 7上MET、MET+3MA和MET+CQ组皮瓣的数字照片（比例尺，1 cm）。（B）定量分析MET组、MET+3MA组和MET+CQ组的生存面积百分比。（C）POD7上MET、MET+3MA和MET+CQ组皮瓣内侧的数字照片（比例尺，1 cm）。（D）各组组织含水量百分比直方图。（E）POD 7上各组皮瓣的全场LDBF图像（比例尺，1 cm）。（F）定量分析皮瓣血流信号强度。（G）H&E染色显示MET、MET+3MA和MET+CQ组皮瓣II区的血管（原始放大×200；比例尺，50μm）。（H）各组MVD百分比柱状图。（一）CD34的IHC显示MET、MET+3MA和MET+CQ组中II区的血管（原始磁感应强度×200；比例尺，50μm）。（J）各组CD34阳性血管百分比直方图。数值表示为平均值±SEM，n个=每组6人。#第页<0.05和##第页与MET组相比<0.01。
图8
图8
MET通过AMPK-mTOR-TFEB信号通路激活自噬。（A）通过TFEB免疫荧光染色（标尺，25μm）观察对照组、MET组和MET+CC组皮瓣细胞中TFEB（红色）的核移位。（B-D）通过Western blotting评估对照组、MET组和MET+CC组中AMPK-mTOR-TFEB信号通路相关蛋白AMPK、p-AMPK，mTOR，p-mTOR、细胞质TFEB和核TFEB的表达，以及MET和MET+CC组中自噬相关蛋白p62，VPS34，CTSD，Beclin1和LC3II的表达。凝胶在相同的实验条件下运行，这里使用的是裁剪过的斑点。（E-G）各组AMPK、p-AMPK，mTOR，p-mTOR、细胞质TFEB、核TFEB，p62、VPS34、CTSD、Beclin1和LC3II表达的光密度值。（H-J）通过Western blotting评估MET、MET+Scramble-control和MET+AMPK-shRNA组中AMPK、p-AMPK，mTOR，p-mTOR、细胞质TFEB、核TFEB，p62、VPS34、CTSD、Beclin1和LC3II的表达。凝胶在相同的实验条件下运行，这里使用的是裁剪过的斑点。（K-M）各组AMPK、p-AMPK，mTOR，p-mTOR、细胞质TFEB、核TFEB，p62、VPS34、CTSD、Beclin1和LC3II表达的光密度值。（N）POD 3和POD 7上MET、MET+CC、MET+加扰控制和MET+AMPK shRNA组皮瓣的数字照片（比例尺，1 cm）。（O）对MET、MET+CC、MET+加扰对照和MET+AMPK shRNA组的存活面积百分比进行量化和分析。数值表示为平均值±SEM，n个=每组6人*第页<0.05和**第页<0.01，与对照组相比；#第页<0.05和##第页<0.01，与MET组相比；&第页<0.05和&&第页<0.01，与MET+Scramble对照组相比。
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