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.2019年2月11日；15（2）：e1007582。
doi:10.1371/journal.ppat.1007582。 eCollection 2019年2月。

14-3-3η伴侣蛋白通过促进MDA5寡聚和细胞内重新分布促进抗病毒天然免疫

Jhih-Pu Lin先生 1 2, 于宽凡 1, 刘敏仪（Helene Minyi Liu） 1
附属公司

14-3-3η伴侣蛋白通过促进MDA5寡聚和细胞内重新分布促进抗病毒天然免疫

Jhih-Pu Lin先生等。 公共科学图书馆-病理学. .

摘要

MDA5属于RIG-I样受体家族，在识别细胞质病毒RNA以诱导产生I型干扰素方面发挥非冗余作用。在RNA配体刺激下，我们观察到MDA5从胞浆重新分布到线粒体膜部分。然而，MDA5激活的分子机制仍不太清楚。在这里，我们表明14-3-3η是MDA5依赖型I型干扰素诱导所必需的辅助蛋白。我们发现一些14-3-3亚型可能通过CARD（N-MDA5）与MDA5相互作用，但14-3-3η是唯一能以剂量依赖性方式增强MDA5依赖性IFNβ启动子活性的亚型。Huh7细胞中14-3-3η的敲除削弱并延迟了MDA5齐聚的动力学，这是MDA5活化的关键步骤。因此，在14-3-3η敲低的细胞中，依赖MDA5的IFNβ启动子活性和IFNβmRNA表达水平也降低。我们还证明，14-3-3η在病毒感染期间对增强MDA5依赖性抗病毒天然免疫的激活至关重要。总之，我们的结果揭示了14-3-3η的一种新功能，通过降低MDA5激活信号通路中病毒dsRNA的免疫刺激潜能来促进MDA5依赖性IFNβ诱导通路。

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数字

图1
图1。活化后，MDA5重新分布到线粒体和/或线粒体相关膜部分。
（A） Huh7细胞用1μg/mL poly（I:C）模拟处理或刺激18小时。作为阳性对照，在poly（I:C）转染细胞中IFIT3蛋白水平升高。然后将细胞裂解物分为胞浆和线粒体-MAM（Mito-MAM）组分，并通过免疫印迹检测内源性MDA5分布。用线粒体相关膜（MAM）（ACSL4）和线粒体（VDAC1）标记物验证膜组分。微管蛋白作为细胞溶质标志物来显示膜分离的效率。（B） 用FLAG标记的MDA5全长、N端或C端部分转染Huh7 WT细胞48小时。通过双重荧光素酶分析评估IFNβ启动子活性。*，p<0.05。（C） 免疫印迹法检测（B）蛋白表达水平。（D） 用FLAG标记的N-MDA5或C-MDA5转染Huh7 WT细胞48小时，并将其分为胞浆和丝裂原-MAM组分。通过免疫印迹测定N-MDA5和C-MDA5的分布。*：非特异性带。
图2
图2。14-3-3η与MDA5相互作用并促进MDA5依赖的抗病毒信号通路。
（A） MDA5和各种14-3-3亚型的共免疫沉淀分析。用带有不同亚型myc标记14-3-3蛋白的FLAG标记全长MDA5转染Huh7细胞，然后用1μg/mL poly（I:C）刺激6小时或不刺激（模拟）。然后对细胞裂解物进行抗FLAG免疫沉淀。星号表示非特定带。（B） 增加剂量的myc标记的14-3-3γ、14-3-3η和14-3-3θ以及恒定量的FLAG-MDA5共同转染到RG-I K/D Huh7细胞中。用双荧光素酶法检测MDA5单独与14-3-3γ、14-3-3η和14-3-3θ异位表达驱动的IFNβ启动子活性。异位表达14-3-3η显著增加了由MDA5表达驱动的IFNβ启动子活性。*：p＜0.05。（C） 免疫印迹法测定图（B）的蛋白质表达水平。（D） 将MDA5单独或MDA5随着myc标记的14-3-3γ、14-3-3η和14-3-3θ剂量的增加转染到RIG-I K/D Huh7细胞中。随后用1μg/mL poly（I:C）刺激转染细胞3至6小时。通过双重荧光素酶分析检测IFNβ启动子活性。*：仅在同一时间点与MDA5相比，p<0.05。#：当比较相同亚型的高表达和低表达14-3-3细胞中IFNβ启动子的活性时，p<0.05。
图3
图3。14-3-3η通过促进MDA5齐聚来控制MDA5的活化。
（A） 在不同时间点用1μg/mL poly（I:C）模拟处理或刺激NTV和14-3-3ηK/D细胞。然后将细胞裂解物分为胞质溶胶或有丝分裂MAM级分，并通过免疫印迹监测内源性MDA5的分布。（B） 对NTV和14-3-3ηK/D Huh 7细胞进行模拟处理，或用100IU/ml IFNβ刺激8小时，然后用0.3的M.O.I感染EMCV 16小时。然后将细胞裂解物分为胞浆或有丝分裂-MAM组分，并通过免疫印迹法监测内源性MDA5和RIG-I的分布。（C） 将FLAG标记的N-MDA5和不同亚型的myc标记的14-3-3蛋白分别联合转染到Huh7细胞中。细胞裂解物进行抗FLAG免疫沉淀。免疫印迹法检测免疫沉淀共回收产物中的14-3-3γ、14-3-3η和14-3-3θ。（D） 将FLAG标记的C-MDA5和不同亚型的myc标记的14-3-3蛋白分别联合转染到Huh7细胞中。细胞裂解物进行抗FLAG免疫沉淀。免疫沉淀回收的蛋白质用免疫印迹法进行分析。未发现14-3-3亚型与FLAG-C-MDA5相互作用。（E） 将全长FLAG标记MDA5（MDA5-FL）或带有点突变（S88A和S88D）的FLAG标记N-MDA5联合转染到带有myc标记14-3-3η的HEK293细胞中。用抗FLAG珠免疫沉淀细胞裂解物，并通过免疫印迹检测不同MDA5突变体与14-3-3η之间的相互作用。（F） 首先用浓度为100 IU/mL的IFNβ处理NTV和14-3-3ηK/D Huh7细胞3小时，然后用poly（I:C）刺激6或24小时。用triton X-100裂解缓冲液裂解细胞，并用SDD-AGE分析MDA5对poly（I:C）转染的聚集。SDS-PAGE后用抗MDA5免疫印迹法分析不同时间点MDA5总蛋白水平。（G） 将越来越多的FLAG-MDA5质粒分别转染NTV和14-3-3ηK/D Huh7细胞。用triton X-100裂解缓冲液对细胞进行裂解，并用SDD-AGE分析FLAG-MDA5的聚集。SDS-PAGE后用抗FLAG免疫印迹法分析不同样品中FLAG-MDA5的总蛋白水平。
图4
图4。14-3-3η是MDA5介导抗病毒活性的关键伴侣蛋白。
（A） 在SeV感染或poly（I:C）刺激期间，NTV和14-3-3ηK/D Huh7细胞的IFNβ启动子活性。首先用pIFNβ-Luc、pCMV-rRL报告质粒转染NTV和14-3-3ηK/D Huh7细胞，然后用SeV或poly（I:C）模拟感染18小时。用双荧光素酶法检测IFNβ的启动子活性。（B） 模拟处理NTV和14-3-3ηK/D Huh7细胞，感染SeV或转染poly（I:C），通过定量RT-PCR监测这些细胞中IFNβmRNA的表达。（C） 模拟转染NTV和14-3-3ηK/D细胞或用1μg/mL poly（I:C）转染3至48小时。提取这些细胞的细胞内RNA，然后通过定量RT-PCR测定poly（I:C）刺激后IFNβmRNA的表达水平。（D和E）NTV或14-3-3ηK/D Huh7细胞被模拟处理或用poly（I:C）刺激9或18小时。通过定量RT-PCR测定IFNβ和OAS1 mRNA的表达水平。（F） 将NTV和14-3-3ηK/D Huh7细胞模拟处理或感染不同M.O.I.的EMCV 18小时。提取这些细胞的细胞内RNA，并通过定量RT-PCR评估EMCV感染后IFNβmRNA的表达水平。（*：p<0.05）（G）NTV和14-3-3ηK/D Huh7细胞被模拟处理或感染EMCV 18小时。通过定量RT-PCR测定细胞内EMCV病毒RNA水平。（*：p<0.05）。
图5
图5。说明MDA5激活的建议模型。
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