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.2019年3月：41:225-235。
doi:10.1016/j.ebiom.2019.01.051。 Epub 2019年2月6日。

GBM样V-ATP酶信号通过大型瘤体引导细胞-细胞肿瘤信号传导和重编程

艾琳·贝尔托里尼 1, 安德烈亚·特拉西 1, 克里斯蒂娜·马泰利 2, 加布里埃拉·高迪奥索 1, 安德烈亚·迪·克里斯托福里 三, 亚历山德拉·玛丽亚·斯托拉西 4, 米里亚姆·福米卡 5, 保拉·布雷多蒂 6, 卡蒂亚·托多尔蒂 7, 斯特凡诺·费雷罗 8, 曼纽拉·卡罗利 三, 路易莎·奥托布里尼 2, 托马斯·瓦卡里 9, 瓦伦蒂娜·瓦伊拉 10
附属公司

GBM-like V-ATPase信号通过大型瘤体引导细胞间肿瘤信号传导和重编程

艾琳·贝尔托里尼等。 EBioMedicine公司. 2019年3月.

摘要

背景：V-ATP酶质子泵控制生理和病理条件下细胞内外环境的酸化。我们之前的研究表明，一些V-ATP酶亚基在胶质瘤干细胞和生存率低的患者中富集。在本研究中，我们研究了GBM-like V-ATPase泵的表达如何影响非肿瘤性脑微环境。

方法：从原发性胶质母细胞瘤（GBM）神经球或患者血清中分离出大癌小泡，并与原发性肿瘤或非肿瘤性脑细胞共同培养。通过qPCR、免疫印迹和免疫金染色分析LO转录物和蛋白质含量。受体细胞中通路的激活是在基因和蛋白质表达水平上确定的。V-ATP酶活性因Bafilomycin A1或基因沉默而受损。

调查结果：GBM神经球通过LO将V-ATP酶亚单位V1G1和同源盒基因HOXA7、HOXA10和POU3F2传递给受体细胞，从而影响其非肿瘤微环境。LOs对受体细胞进行重新编程，使其增殖、生长为球形并迁移。此外，在GBM患者的循环中LO特别丰富，生存时间短。最后，V-ATP酶受损会降低LO活性。

解释：我们确定了神经胶质瘤干细胞通过LO介导的微环境重编程来促进疾病进展的一种新机制。我们的数据为基于LO的液体活检的未来发展提供了初步证据，并建议了一种新的潜在策略来对比胶质瘤的进展。资金：这项工作得到了卡里普洛基金会（2014-1148 to VV）和意大利卫生部长科伦特计划（2017 to SF）的支持。

关键词：胶质瘤干细胞；同源框基因；大型瘤体；V-ATP酶。

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数字

图1
图1
质子泵高肿瘤在体内也在其外围表达较高水平的同源异型盒基因。a、 b）用免疫组织化学方法（IHC）评估同源域基因HOXA10和POU3F2在颅内注射不同V-ATPase G1水平的NS所产生的原位胶质瘤中的表达。通过苏木精-伊红染色（H&E）评估组织形态，而使用人类细胞特异性抗体（STEM121）和同源域蛋白通过双重IHC评估肿瘤细胞中HOXA10或POU3F2的表达。a） 代表性图像（另请参见补充图S1a）。虚线 = 肿瘤边界。HOXA10和POU3F2评分采用数字算法进行核染色，并表示为阳性肿瘤细胞核在总肿瘤细胞群中的百分比（计数掩码a；b，量化；n = 7). ***, 第页 = 0·0006; **, 第页Ş=Ş0.001（曼希特尼U型测试）。c） IHC在人类GBM、周围非肿瘤实质（边缘）和远处检测到V-ATPaseG1、HOXA10和POU3F2（另见补充图S1c）。通过形态学（H&E）和免疫表型检查（Nestin染色阴性）确定是否存在肿瘤细胞。比例尺，200 微米。d） 通过激光辅助显微切割（n = 8名患者）。*，第页Ş=Ş0·01; #, 第页 = 0·03; §，p = 0·02（Mann-Whitney U检验）。RQ，相对数量。在b和d中，数据以方框图形式显示，胡须表示最小值和最大值。每个样本都是一个点。
图2
图2
来自GBM NS的大型瘤体携带并向受体细胞传递V-ATPaseG1和同源域转录物。a） GBM NS内细胞的电子显微镜（EM）显示存在丰富的细胞外小泡。b） 从NS培养基纯化的大瘤体（LO）的典型EM图像。比例尺，500 纳米。c） 通过蛋白质印迹法测定LO特异性蛋白标记的存在/缺失，并与相应的细胞裂解物（NS）中的标记进行比较。MW，分子量。d） 纯化的LO或空培养基（模拟）用PKH26染色。共聚焦显微镜观察受体细胞（LN229细胞）对LO的内化作用。使用CellTrace染料对细胞质进行可视化。比例尺，50 微米。e） LO中显示的转录物来自高V1G1的NS高)或低（V1G1LOW（低）)用qPCR检测V-ATPaseG1水平。条形图，平均值 ± 使用免疫金标记法分析高（i）或低（ii）V-ATP酶G1的NS的SEM.f）LO中V-ATP酶的G1表达。比例尺，500 纳米。g、 h）所示转录本的表达（RQ；g；bar，平均值 ± 与来自高（+LO）NS的LO共培养后，评估受体细胞（非球形原代胶质瘤培养物）中的SEM）或蛋白质（h；另见补充图S3b）高)或低（+LO低)V-ATPase G1表达，或用空培养基（模拟）。比例尺，50 微米。在g中，虚线表示在ViG1中检测到的转录物水平高神经球（NS）。i） 6或90天后评估受体细胞（非球形原代胶质瘤培养物）中同源结构域基因或V-ATPase G1的表达 与LO共同培养的天数高.RQ，相对数量。条形图，平均值 ± 扫描电镜。
图3
图3
润滑油高重新编程受体细胞以激活致瘤途径。a–c）原发性非肿瘤边缘用活性染料太平洋蓝染色，细胞与指定的LO或空培养基（模拟）共同培养。在3、10和17天后，通过亮场显微镜监测细胞活力和增殖 天（a，第10天的代表性图像）和FACS分析（b，c；另请参见补充图4a，b）。比例尺，100 微米。d） 原代非球形胶质瘤培养物补充指定的LO或空培养基（模拟），并在3和6天后监测其形态和免疫表型 天。左侧，用分化的胶质细胞（GFAP）和丝状肌动蛋白（Phalloidin）标记物染色的受体细胞的代表性图像。赖特，对在指定时间共同培养后形成的肿瘤球进行量化。§，p < 0.0001（Anova与Tukey的后测）。e） 低水平V-ATPase G1（侵袭性低）的NS与LO共同培养高，润滑油低或空白培养基（模拟培养基），并监测肿瘤细胞在胶原基质中的扩散3 通过延时显微镜观察。左侧，播种时NS的代表性图像（全线）和铺展后NS的代表图像（虚线）。赖特，胶原基质浸润面积的量化。**，第页 = 0.008（Anova与Tukey的后测）。另请参见补充图3d。f） 监测并量化由原代非球形胶质瘤细胞与指定的LO或空培养基（模拟）共同培养形成的肿瘤球的存在和活性(左边面板），最多90 天。*，第页 = 0·036; #, 第页 < 0.0001（Anova与Tukey的后测）。g） 与LO共培养后，通过qPCR对原代非球形受体胶质瘤细胞中的指示转录物进行量化高然后比较90岁后存活的文化之间的转录表达 补充LO的天数和迅速消失的培养物（第21天之前）。RQ，相对数量。h） GSEA富集评分曲线。使用从与LO共培养的原代非球形胶质瘤细胞中获得的转录组进行基因集富集分析（GSEA）高或空介质。每个面板上都显示了路径（KEGG）或GO术语富集图的名称。根据基因与LO-（红色）或模拟补充（蓝色）表型的相关性，使用“平均值差异”度量对基因进行排序。NES，归一化富集分数；调整p值，p值调整为假发现率。在面板c-g中，数据表示为平均值 ± SEM。（关于本图例中颜色参考的解释，读者可参考本文的网络版。）
图4
图4
GBM患者的循环LO携带V-ATPase G1和Homeodomain蛋白。a） 用电子显微镜分析从GBM患者血清中纯化的LO。显示了两个不同患者的典型图像。比例尺，500 纳米。b） 患者衍生的LO（用PKH26染色）通过原代非肿瘤边缘培养物（用CellTrace活性染料染色）内化。比例尺，10 微米。c） 通过从指定患者血清中纯化的LO的western blotting分析蛋白质标记物。另请参见补充图S5a。d、 e）qPCR分析ATP6V1G1型（D） 或POU3F2（E） IDH突变患者循环LO中的转录物（n = 8） 或野生型（n = 3） LGG（分别为LGG/IDHmut和LGG/IDHwt）或GBM（n = 17) (左边图），GBM患者根据生存状态(正确的图表）。每个点代表一个样本，数据表示为平均值 ± SEM.RQ，相对数量。f） 利用Youden的统计数据生成ROC曲线，以确定POU3F2LGG/IDHmut和GBM患者LO中的表达最能区分疾病。g） 根据ROC生成的截止值，LGG和GBM患者被分为POU3F2-低和-高类别，并分析了他们在两组中的频率。*，第页 = 017（卡方检验）。条形图表示每组患者的数量。h） 使用Kaplan-Meier曲线和Log-Rank检验分析了归类为POU3F2-低或高的LGG患者的时间进展。
图5
图5
用巴非霉素A1处理NS可降低LO含量和生物效应。a、 b）NS用5 nM巴氟霉素A1（BafA1；a）24小时 h、 或使用针对HOXA7或V-ATPase G1（V1G1）或非特异性分子（Ctrl）的特异性siRNA（b）48 h.然后用western blotting检测细胞质和细胞核部分（a）或全细胞裂解物（b）的蛋白质含量。层粘连蛋白A/C和文丘林分别用作核组分和细胞质/总组分的负荷控制。c） 具有代表性的EM图像显示使用5 nM BafA1或带有靶向V-ATP酶G1的siRNA。比例尺，1 微米。d） 使用靶向V-ATPase G1（V1G1）或模拟（Ctrl）的siRNA处理后，分析NS或LO中的指示转录物。用模拟siRNA（Ctrl）处理的样品中靶标的表达被设置为1（红色虚线）。条形图，平均值 ± 通过western blotting分析了V-ATPase G1低或高表达NS或BafA1处理NS的SEM.e）LO。细胞裂解物（CL）作为对照。f） 来自BafA1-（LO-BafA1）或车辆处理（LO-Ctrl）NS的LO用PKH26染色，并与受体细胞孵育（用CellTrace染色的LN229），LO内化被监测24小时 小时。赖特LO阳性细胞的定量。比例尺，50 微米***，第页 < 0.0001（曼希特尼U型测试）。每个点代表一个样本，条形表示平均值 ± SEM.g）受体细胞（原代、非肿瘤边缘）用CellTrace紫染色，并与空培养基（模拟）、LO-BafA1或LO-Ctrl共培养10 天。然后，收集细胞并用流式细胞仪进行分析。左侧，直方图显示代高峰，代表连续的细胞分裂。赖特，每组分裂细胞的百分比。**，第页 = 0·008; *, 第页 = 0·01（Mann-Whitney U试验）。条形图，平均值 ± SEM.h，i）用qPCR（h）或免疫荧光分析检测与LO-BafA1共同培养的受体细胞（非球形原代胶质瘤培养物）中同源框基因。对于qPCR实验，每个目标的LO-Ctrl设置为1。比例尺，50 微米。条形图，平均值 ± 扫描电镜（n = 6). j） 将原代非球形胶质瘤细胞与空白培养基（Mock）、LO-Ctrl或LO-BafA1共同培养，并对其生成NS的能力进行6次监测 天。赖特，每个培养物形成的球体数量（n = 三；点，平均值 ± SEM）。比例尺，10 微米。§，LO-BafA1与LO-Ctrl，p < 0·01; #, 模拟与LO-Ctrl，p < 0·001; *, LO-BafA1与LO Ctrl和Mock与LO Ctrl，p < 0.001（Kruskal-Wallis检验和Dunn的后验）。（对于本图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的网络版。）
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