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案例报告
.2019年2月5日；10(1):605.
doi:10.1038/s41467-019-08493-7。

LAP1B和LAP1C的联合丢失导致早发性多系统核包膜病

鲍里斯·费希特曼 1, 法迪亚·扎盖里 1, 尼赞·比兰 1, 伊夫塔·巴舍舍特 1, 埃琳娜·切尔文斯基 2, 齐瓦·本·内里亚 三, 阿夫拉罕·沙格 4, 迈克尔·阿萨 1, 奥利·埃尔佩莱 4, Amnon Harel公司 5, Ronen Spiegel公司 6 7
附属公司
案例报告

LAP1B和LAP1C的联合丢失导致早发性多系统核包膜病

鲍里斯·费希特曼等。 国家公社. .

摘要

核包膜病是由编码核包膜蛋白的基因突变引起的一组异质性疾病。影响层膜相关多肽1（LAP1）的突变导致两种离散的表型，即肌营养不良和进行性肌张力障碍伴小脑萎缩。我们报告了7名患者，他们在出生时表现为严重的进行性神经损伤、双侧白内障、生长迟缓和早期死亡。所有患者都是TOR1AIP1基因无义突变的纯合子，导致蛋白亚型LAP1B和LAP1C的丢失。患者来源的成纤维细胞表现出核膜形态的变化和含有胞质细胞器的大跨核通道。在这些成纤维细胞中也观察到细胞运动减少和效率低下。我们的研究描述了两种主要人类LAP1亚型的完全缺失，强调了它们在早期发育和器官发生中的关键作用。因此，LAP1相关缺陷可能包括广泛的临床范围，这取决于核膜中两种亚型在一生中的可用性。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
患者的典型临床特征。一——c（c）特征面部特征，包括白内障摘除术(b条)两名患者（III-3、IV-4）患有小眼症、深陷眼和上嘴唇凹陷。患者III-3的年龄为1.5岁(b条)和3年(c（c）).d日以“蛙式”卧位为特征的严重躯干张力减退。e（电子）下肢多毛症。如果胃造口管以及血管皮肤改变（网状活体）。克患者III-3的T1矢状位MR显示胼胝体发育不全（红色箭头）、小脑萎缩（黄色箭头）和皮质萎缩。小时患者IV-4的T2轴磁共振显示脑室扩大（黄色箭头）和与颞叶萎缩一致的广泛开放的侧裂（红色箭头）所示的全皮层萎缩
图2
图2
无意义的突变TOR1AIP1型导致两种膜相关多肽1（LAP1）亚型的丢失。一桑格测序法TOR1AIP1型c.961C>野生型、杂合子和纯合子个体基因组DNA中的T变异。变量位置用箭头标记。b条主要LAP1蛋白亚型和先前描述的突变的示意图——TM跨膜段。较短的LAP1C亚型被认为来自于密码子122的内部翻译起始。两个先前描述的移码突变只会影响LAP1B亚型并导致短截短产物，而两个错义突变位于管腔结构域。当前研究中确定的第321密码子无义突变以红色突出显示。有关更多详细信息，请参阅参考文献。c（c）对两名患者（患者1:III-3；患者2:IV-4）和三名无关对照组培养的原代皮肤成纤维细胞的细胞裂解物进行免疫印迹分析。蛋白印迹与针对LAP1、emerin、层粘连蛋白A和α-微管蛋白的抗体反应。多克隆抗LAP1抗体是针对LAP1B和LAP1C亚型共同的一个区域生成的（如对照组所示），因此有望识别截断的N末端片段。参见补充图2d，了解该印迹的较长暴露时间。底部显示了三种独立的裂解物和免疫印迹中emerin带强度的定量（参见：方法；条表示SEM）。d日通过定量实时聚合酶链反应分析来自两名患者和两名对照的原代皮肤成纤维细胞的成熟mRNA水平。LAP1和emerin的结果归一化为β-微管蛋白，代表三个独立实验的平均值和标准差
图3
图3
患者源性成纤维细胞中存在明显的异常核表型。一对照组和患者衍生（患者1:III-3；患者2:IV-4）成纤维细胞用抗层粘连A/C和抗蛋白二硫异构酶（抗PDI）抗体进行免疫染色，并用共焦显微镜进行分析。代表性图像显示在左侧，所选区域被放大。抗PDI染色边缘标记核膜（NE），对照组可见明显的抗层粘连核边缘染色。对2个对照细胞系和2个患者细胞系的抗层粘连染色强度进行定量分析，使用自定义的ImageJ宏定义1 围绕NE的µm宽环（有关更多详细信息，请参阅：方法）。右侧显示了相对染色强度测量的摘要(n个 ≥ 30; 条表示SEM）。比例尺，1 微米。b条通过DNA（Hoechst 33258）和抗层粘连蛋白A/C染色，使用宽场免疫荧光，在来自两种患者来源的原代成纤维细胞系的一些细胞核中观察到细胞质通道。星号表示原子核含有通道，在宽视野和高倍镜下显示。频道用箭头标记。底部的廊道展示了一组DNA染色的细胞核，这些细胞核形状扭曲，含有1-3个不同大小的通道。这种通道仅在患者来源的成纤维细胞细胞核中观察到。条形图显示了2个对照细胞系和2个患者细胞系中通道发生的定量分析（从下到右；n个 = 4个独立实验中150个；条表示SEM）。比例尺，20 微米
图4
图4
细胞质通道自上而下穿过患者细胞核。用mAb414间接免疫荧光染色对照组和患者来源的细胞核的核膜（NE）中的核孔复合体，并用共焦显微镜成像。显示了一个对照组和一个患者衍生细胞核的单个光学切片。A满z（z）-由27个光学部分组成的堆栈，用70个 患者衍生成纤维细胞的nm步长如右图所示。注意的放大侧视图x个和年轴表明通道穿过整个原子核。NE核孔隙复合体分布评估见图5。比例尺，10 微米
图5
图5
患者细胞核含有复杂的通道，其中含有被捕获的细胞质细胞器。控制(一)和患者来源的原代成纤维细胞(b条,c（c）)按照方法所述，制备用于透射电子显微镜。红色和蓝色虚线表示后续面板中放大的区域。通过固定附着的细胞，然后刮去表面，进一步固定、包埋和制备薄片，获得侧视图。通过不同的制备方案获得俯视图，其中细胞被固定并直接嵌入盖玻片表面，以确保所有细胞的方向一致。一对照组成纤维细胞的侧视图和俯视图显示核形态正常，无细胞质通道。放大的区域显示了两个核膜、核周间隙和核孔复合体的横截面。b条患者衍生成纤维细胞的侧视图和俯视图。从侧面看，一个细胞质通道从上到下横切扁平的细胞核。注意靠近通道顶部开口的细胞质细胞器。俯视图显示，单个细胞包含一个复杂的、不规则形状的通道，该通道被一个双层膜的核膜包裹。左下角的面板中可以识别出双膜和横截面上的典型核孔（箭头）。箭头指向被困住的细胞质细胞器。c（c）来自不同患者来源的成纤维细胞的附加俯视图。注意几个较小的疑似通道，横截面可见，明显被双核膜包围。比例尺：黑色2 µm，红色400 纳米
图6
图6
患者源性成纤维细胞的细胞运动受损。一在IncuCyte ZOOM™划痕伤口试验中，对对照组和患者源性成纤维细胞的伤口闭合活性进行定量分析。细胞在96-well板中生长形成单层，用WoundMaker制作均匀划痕TM（TM）右图：一个对照组和两个患者衍生细胞系的伤口汇流图，每2个记录一次 总持续时间为126小时 h、 显示方法 ± 每个细胞系中六个重复的扫描电镜。左：显示初始位置的分段和遮罩代表图像(t吨 = 0）和52天后伤口闭合的程度 h.在两种患者衍生系中均观察到细胞迁移和伤口闭合的显著延迟。b条稀疏镀膜对照组和患者衍生成纤维细胞的随机二维（2D）细胞运动。左图：来自一个对照细胞系和两个患者衍生细胞系的单个细胞的轨迹图。每隔30次采集图像 总共20分钟 h使用IncuCyte ZOOM™采集软件。右：定量分析速度、累积距离（细胞路径总长度）和欧氏距离（迁移起点和终点之间的最短距离）；n个 = 49（控制），n个 = 83（患者1），n个 = 56（患者2）；条形图表示SEM。在所有参数中，观察到两条患者线的2D运动降低
图7
图7
通过转导膜相关多肽1B（LAP1B）和LAP1C编码结构修复核形态和细胞运动缺陷。构建了由EF1a启动子驱动的编码LAP1B或LAP1C的多顺反子慢病毒载体，其中包含两个内部核糖体进入位点序列EGFP或mCherry和一个嘌呤霉素抗性标记，并按照方法制备慢病毒颗粒。用含有LAP1B-编码、LAP1C-编码或空质粒对照的慢病毒颗粒转导对照组或患者1的原代成纤维细胞系。经过几轮抗生素选择和对所有细胞中荧光标记表达的目视验证，在三次单独的分析中对稳定转染的细胞系进行了分析，所有分析均表明缺陷得到了部分但显著的逆转。一如图3b所示，通过广域免疫荧光分析稳定转染的患者1细胞系细胞核中细胞质通道的出现(n个 = 两个独立实验中110个，重复进行；条表示SEM）。b条如图6a所示，在划痕伤口试验中，同时分析三种细胞系的伤口闭合活性。将原始未转染对照成纤维细胞与稳定转染LAP1B-编码或LAP1C-编码的患者1细胞系以及等效的空质粒对照进行比较。随着时间的推移对伤口汇合进行绘图，每2次记录一次图像 总持续时间为72小时 h、 显示方法 ± 每个细胞系中六个重复的扫描电镜。c（c）通过轨迹图和定量分析分析随机二维（2D）细胞运动，如图所示。第6b段。n个 = 73（对照，空质粒），n个 = 62（患者1，空质粒），n个 = 52（患者1，LAP1B）；n个 = 58（对照，空质粒），n个 = 51（患者1，空质粒），n个 = 67（患者1，LAP1C）；条表示SEM。d日尝试使用LAP1B和LAP1C编码结构实现联合救援。用两个空质粒和两个LAP1编码质粒稳定转染的患者1细胞进行了直接比较。请注意，尽管在轨迹图分析的所有细胞中都观察到GFP和mCherry，但由于缺乏第二选择标记，该实验无法在最佳条件下进行。如上所述分析2D中的随机细胞运动。虽然观察到了获救的运动能力，但定量分析参数并没有显示出超出LAP1B构建物单独实现的协同效应(c（c），顶行）。n个 = 53（患者1，空质粒），n个 = 78（患者1，LAP1B+LAP1C）；条表示SEM
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