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.2019年2月4日；10(1):584.
doi:10.1038/s41467-019-08388-7。

带图案的人微血管移植物可使梗死大鼠心脏快速血管化并增加灌注

梅雷迪斯·A·雷德 1 2 三, 妮可·泽因斯特拉 1 2 三, 万勤 1, 魏伟 1, 艾米·马丁森 2 三 4, 王玉良 三 5, 王瑞康 1, 查尔斯·默里 6 7 8 9 10, 应征 11 12 13
附属公司

带图案的人微血管移植物可使梗死大鼠心脏快速血管化并增加灌注

梅雷迪斯·A·雷德等。 国家公社. .

摘要

血管化和有效灌注是心脏组织工程长期以来面临的挑战。在这里，我们报道了工程化可灌注微血管构建，其中人类胚胎干细胞衍生的内皮细胞（hESC-EC）植入到有图案的微通道和周围的胶原基质中。在体外，排列在管腔壁上的hESC-EC很容易萌芽，并在流动状态下与基质中新生的内皮管吻合。植入梗死大鼠心脏后5天，可灌注微血管移植物与冠脉系统的结合程度高于非灌注自组装结构。光学微血管成像显示，可灌注移植物的血管密度增加6倍，血管速度增加2.5倍，体积灌注率增加20倍以上。植入含有额外hESC衍生心肌细胞的可灌注移植物显示出较高的心肌细胞和血管密度。因此，预先形成的血管网络可增强血管重塑并加速冠状动脉灌注，从而可能支持植入后的心脏组织。这些发现将有助于下一代心脏组织工程的设计。

PubMed免责声明

利益冲突声明

C.E.M.是Cytocardiar的科学创始人和股东。R.K.W.公开了俄勒冈州健康与科学大学和华盛顿大学拥有的与OCT血管造影相关的知识产权（US8180134体内结构和流动成像（2006）、US9013555超高灵敏度光学微血管造影方法和仪器（2009）），并授权给商业实体，这与本文部分描述的技术和分析方法有关。R.K.W.还获得了卡尔蔡司医疗技术公司、Moptim公司、脸书科技有限责任公司和高露洁棕榄公司的研究支持。他是Insight Photonic Solutions、Kowa和Carl Zeiss Meditec的顾问。所有其他作者都声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
人类胚胎干细胞衍生内皮细胞（hESC-ECs）在工程化微血管（µVs）中的体外吻合。一μV+SA构建体的体外培养装置示意图：mTm-hESC-ECµVs通过灌注和在周围胶原凝胶中附着大量GFP-hESC-ECs形成。b条缝合大图像共焦的最大强度投影z（z）-μV+SA构建物堆叠培养4天，染色DsRed（红色）和GFP（绿色），分别检测mTm-和GFP表达的hESC-ECs。比例尺，500 微米。c（c）轮廓区域（白框）b条DsRed（红色，左上）、GFP（绿色，右上）和VE钙粘蛋白（白色，左下）染色。合并的图像，右下角。比例尺，200 微米。d日GFP-hESC-ECs（绿色）与mTm-hESC-EC（红色）图形血管在μV+SA结构中的高倍图像。比例尺，50 微米。e（电子）培养4天和7天后，通过芽密度（每个血管表面积的芽数）、芽长和芽直径（仅以μV为单位）（蓝色圆圈）和μV+SA（绿色圆圈）对带图案µV中的芽进行定量。N个 = 仅D4μV、D4μV+SA、D7μV和D7μV+SS的6、7、4和3个生物独立样本。第页 = 长度为0.011第页 = 仅D4μV和D7μV的直径为0.007，第页 > 0.05适用于所有其他（双尾t吨测试）。（f）经CD31（红色）和GFP（绿色）染色的GFP+新生管腔与mTm+微血管芽（白色箭头）整合的3D视图。比例尺，100 微米。的代表性图像b条——d日,（f）来自7个D4μV+SA的生物独立样本，结果相似。赫斯特染色细胞核，蓝色。误差线，平均值 ± 扫描电镜*第页 < 使用双尾确定0.05t吨测试。培养4天后为D4，培养7天后为D7
图2
图2
工程微血管的荧光珠灌注（µVs）。一带灌注吻合连接的µV+SA结构。轮廓区域i和ii的高倍视图，带有mTm-hESC-ECs（DsRed+，红色）和GFP-hESC-EC（GFP+，绿色）的相应原位染色。比例尺，100 微米，40 微米。b条荧光珠在两个时间点的高放大率视图，t吨0和t吨1, 0.27 分开。红色箭头跟踪荧光珠的移动以计算速度。c（c）,d日图案容器中的平均珠速度(c（c）)直径<50的芽中 微米(d日)培养4天和7天后，仅在µV（蓝色圆圈）和µV+SA（绿色圆圈）中构建N个 = 3、3、4和3个生物独立样本，分别用于D4µV、D4¦ΜV+SA、D7¦Μ）V和D7¦的V+SA。第页 = 芽中D4µV+SA和D7µV+SA为0.004，第页 = 芽中的D7µV和D7¦ΜV+SA为0.012，第页 > 0.05适用于所有其他（双尾t吨测试）。e（电子）珠速与芽直径的散点图N个 = 在2、1、5和3个生物独立样本中，仅针对D4µV、D4¦ΜV+SA、仅针对D7¦µV和D7µV+SA，分别为15、20、37、53（分析的芽数）。的代表性图像一,b条来自三个D4µV+SA的生物独立样本，结果相似。赫斯特染色细胞核，蓝色。误差线，平均值 ± 扫描电镜*第页 < 使用双尾确定0.05t吨测试。ns不显著(第页 > 0.05). 培养4天后为D4，培养7天后为D7
图3
图3
工程微血管柠檬酸化全血灌注（µVs）。一Brightfield为人类胚胎干细胞衍生内皮细胞（hESC-EC）接种的µV仅在培养4天后构建的细胞，缝合了红色血细胞填充模式的大图像，并在放大视图（插图，白色虚线边界）下萌芽。比例尺，200 微米。b条共焦最大强度投影z（z）-灌注30分钟后，对未经处理的hESC-EC种子构建物（顶部）和经佛波酯-肉豆蔻酸盐（PMA）处理的hESC-EC种子构建物进行磷酸缓冲盐水（PBS）洗涤，并对其进行CD31（红色）和CD41a（绿色）染色。比例尺，200 微米。c（c）在对照条件（C–HUVEC）、对照条件（C-hESC-EC）和经PMA或白细胞介素（IL）-1β（IL-1β–hESC-EC）处理的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）接种构建物血管壁上血小板粘附的定量。数据表示为容器壁表面积的百分比。N个 = C-HUVEC、C-hESC-EC、PMA和IL-1β分别为2、2、2和3个生物独立样本。的代表性图像一,b条来自两个生物独立的C-hESC-EC样品和两个生物无关的PMA-hESC-EC样品，结果相似。误差线，平均值 ± 扫描电镜
图4
图4
全球RNA测序显示了体外培养3天后自组装（SA）、仅µV和µV+SA构建体之间的差异基因表达谱。一培养构建体的RNA测序数据的2D主成分分析（PCA），显示了每种条件下的聚类组。b条,c（c）PC1的主要基因：b条圆圈的大小与贡献成正比。c（c）前75个基因的热图（log2CPM）在分类功能中有助于PC1。颜色映射规范化为最小和最大表达式。红色，高表情。蓝色，低沉的表情。d日基因本体术语分析（GO）显示了μV+SA与SA（左）以及μV与SA（右）的不同基因簇。每个样本是两个结构的集合。百万CPM计数
图5
图5
在梗死大鼠心脏模型中植入血管构筑物，并对植入后5天的实时灌注进行光学微血管成像（OMAG）评估。一——c（c）基于多普勒的Langendorff灌注移植心脏血管血流图像一健康区域，b条对照移植物（自组装（SA）），以及c（c）图案化可灌注移植物（μV+SA）。顶部面板，高分辨率，非定量OMAG图像。底部面板，OMAG-V图像，强度和速度之间具有线性相关性。比例尺，500 微米。d日SA移植物和μV+SA移植物的OMAG流动数据的三维视图以及OMAG结构和流动数据的叠加。比例尺，500 微米。e（电子）SA和μV+SA的健康（红色圆圈）和移植物（紫色圆圈）区域灌注血管的血管密度定量。N个 = SA和μV+SA分别为9只和8只生物独立动物。第页 = SA健康和移植物为0.0009，第页 = μV+SA健康和移植物为0.0016，第页 = SA和μV+SA移植物为0.0012，第页 > 0.05适用于所有其他（双尾t吨测试）。（f）小动脉（直径在20到40之间）中血流速度的测速测量 μm）健康和移植区域。N个 = SA和μV+SA分别为5只和6只生物独立动物。第页 = 0.016适用于SA健康和移植物，第页 = SA和μV+SA移植物为0.023，第页 > 0.05适用于所有其他（双尾t吨测试）。克根据测速数据得出SA和μV+SA移植物的体积灌注率。N个 = SA和μV+SA分别为5只和6只生物独立动物。第页 = SA和μV+SA移植物为0.038（双尾t吨测试）。代表性图像一——d日来自5只含有SA移植物的生物独立动物，6只含有μV+SA移植物且生物独立的动物，以及来自所有含有移植物的动物的11个相应健康区域，结果相似。误差线，平均值 ± 扫描电镜*第页 < 0.05, **第页 < 0.01使用双尾确定t吨测试
图6
图6
植入后5天检测移植物中的人内皮细胞和灌注血管。一,b条自组装（SA）和µV+SA移植物的免疫荧光染色石蜡切片：一人胚胎干细胞衍生内皮细胞（hESC-ECs）（DsRed+，红色）和灌流大鼠和人内皮细胞（凝集素+，绿色）。合并图像中的白色箭头表示双阳性细胞。比例尺，100 微米。b条人胚胎干细胞-内皮细胞（DsRed+，红色）和灌注人内皮细胞（UEA I+，白色）。合并图像中的黄色箭头表示双阳性细胞。比例尺，100 微米。c（c）血管密度量化（每毫米血管数2)以及移植物中hESC EC血管（DsRed+，红色圆圈）和所有灌注血管（Lectin+，蓝色圆圈）的平均血管尺寸。N个 = SA和µV+SA移植物的6只生物独立动物。第页 = 凝集素+血管用于SA和µV+SA为0.045，第页 = DsRed+为0.018，µV+SA为凝集素+，第页 > 0.05适用于所有其他（双尾t吨测试）。d日定量移植物中灌注人类血管（UEA I+，灰圈）的血管密度和平均血管尺寸。N个 = SA和µV+SA移植物均为6只生物独立动物，其中一只具有µV+SA移植物的动物因缺乏UEA I+血管而被排除在血管尺寸计算之外。第页 = SA和µV+SA的容器尺寸为0.023，第页 > 0.05表示血管密度（双尾t吨测试）。的代表性图像一,b条来自6只含有SA移植物的生物独立动物和6只含有μV+SA移植物且生物独立的动物，结果相似。赫斯特染色细胞核，蓝色。数据采集自每个样本随机选择区域的至少三个共焦图像，并通过血管密度和大小的自定义管腔识别码进行分析。误差线，平均值 ± 扫描电镜*第页 < 使用双尾确定0.05t吨测试。欧洲联盟欧洲榆凝集素I
图7
图7
植入后5天梗死大鼠心脏模型中的可灌注心脏构筑物一,b条自组装（SA；左）和µV+SA（右）心脏移植物的免疫荧光染色石蜡切片：一含有人类胚胎干细胞衍生心肌细胞（hESC-CMs）（β-MHC，红色）的全移植切片。灰色虚线勾勒出移植组织。比例尺，1 毫米。b条中方框区域的高倍图像一（黄色框）带有hESC-CM（β-MHC，红色，右下）和灌注血管（凝集素+，绿色，左下）。合并，顶部。比例尺，100 微米。c（c）心肌细胞密度的量化（每毫米β-MHC+细胞的数量2)β-MHC+移植物大小（%LV面积）。N个 = SA和µV+SA的7只和6只生物独立动物，其中一只带有µV+SA移植物的动物因组织处理过程中移植物部分切除而被排除在移植物大小计算之外。第页 = 密度为0.015，第页 > 嫁接尺寸为0.05（双尾t吨测试）。d日血管密度量化（每毫米血管数2)心脏移植物中所有灌注血管（凝集素+）的平均血管尺寸。N个 = SA和µV+SA分别为7只和6只生物独立动物。第页 = 容器密度为0.046，第页 > 容器尺寸为0.05（双尾t吨测试）。e（电子）SA（左）和µV+SA（右）心脏移植物石蜡切片上凋亡细胞（TUNEL，绿色）的末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP-荧光素缺口末端标记（TUNEL）检测。比例尺，100 微米。（f）凋亡细胞（TUNEL+）在移植物中占所有细胞（人类和宿主）的百分比定量。N个 = SA和µV+SA分别为7只和6只生物独立动物。第页 > 0.05（双尾t吨测试）。的代表性图像一,b条,e（电子）来自6只含有SA移植物的生物独立动物和5只含有μV+SA移植物且生物独立的动物，结果相似。赫斯特染色细胞核，蓝色。数据采集自每个样本随机选择区域的至少两个共焦图像。通过定制管腔识别码分析血管密度和大小的图像。误差线，平均值 ± 扫描电镜*第页 < 使用双尾确定0.05t吨测试。β-MHCβ-肌球蛋白重链
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