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.2019年2月18日；8（2）：生物035691。
doi:10.1242/bio.035691。

紫外线B诱导晶状体上皮细胞Otx2表达促进上皮-间充质转化

吉藤康夫 1, 大田博美 2, Haruka Satake公司 1, 小岛正美 三, 斋藤英彦（Hidehito Saito-Takatsuji） 1, 池田隆彦 1, 吉野吉昭 1, 石垣康仁 4, 埃里·库博 2, 佐佐木浩 2, Hideto Yonekura公司 5
附属公司

紫外线B诱导晶状体上皮细胞Otx2表达促进上皮-间充质转化

吉本雅雄等。 Biol开放. .

摘要

眼睛的紫外线（UV）辐射是白内障形成的一个主要风险因素，尽管这一过程的分子机制仍不清楚，受紫外线辐射影响的基因也尚未完全确定。在本研究中，我们检测了小鼠眼睛晶状体上皮细胞（LECs）中与紫外线相关的基因调控，并探讨了紫外线诱发白内障发生的分子机制。紫外线照射后，LEC中有41个基因显著上调体内在两个独立的实验中。其中，Otx2在LECs中强烈上调，表明它可能是UVB诱导的基因表达变化的上游调节器。因此，Otx2在LECs中过度表达在体外诱导细胞形态的改变。上皮-间充质转化（EMT）相关分子，如TGFβ2、αSMA和纤维连接蛋白，在Otx2过度表达的LECs中上调，同时伴有晶状体纤维细胞标记基因的抑制，如CRYAA和DNASEIIB。体外实验表明，UVB通过产生过氧化氢上调Otx2。紫外线照射后LECs中Otx2的异常上调导致EMT和晶状体细胞特征的改变，可能导致白内障的发生。

关键词：白内障；上皮-间充质转化（EMT）；Otx2；紫外线照射。

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利益冲突声明

竞争利益作者声明没有竞争利益或财务利益。

数字

图1。
图1。
UVB照射小鼠晶状体上皮细胞的基因表达谱。（A） 对辐射实验中使用的UVB光源的波谱进行了分析。（B） 小鼠右眼在30时暴露于紫外线 毫焦耳/厘米2，而他们的左眼被铝箔覆盖，作为对照。（C） UVB照射对小鼠晶状体上皮细胞基因表达谱的影响体内通过微阵列实验进行分析，筛选出41个差异表达基因（DEG），这些基因的变化超过1.8倍P（P）<0.01。（D） 热图中显示了两个独立实验中每个基因上DEG的标准化信号强度。（E） 灵巧途径分析软件（IPA）确定了DEG在特定分子和功能途径中的富集，以及DEG中可能的上游调控因子。
图2。
图2。
Otx2在有或无UVB照射的小鼠和人类晶状体上皮中的表达。（A） 通过RT-qPCR证实Otx2在经紫外线照射或未经紫外线照射的晶状体上皮细胞（LECs）中的表达。（B） 小鼠晶状体矢状切面体内用抗Otx2抗体或正常IgG作为阴性对照，对含有表面和过渡区LECs的UVB照射实验进行染色，并用LSM 710共聚焦显微镜捕获荧光图像。e、 LEC；r、 视网膜细胞。比例尺：100 微米。（C） 对五个随机选择的图像的Otx2染色中细胞的单个荧光强度进行量化，并比较其晶状体上皮（表面积）和过渡区。显示量化细胞的数量。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。（D） 收集了6名患者的人类晶状体上皮细胞，并进行了UVB照射实验。通过RT-qPCR分析Otx2的表达并进行量化。每一半记录三次测量的平均值。对于C和D中的曲线图，所有数据点都用点表示，中间带用横条表示，横条由样本之间的实心对角线连接。D中的虚线表示RT-qPCR测量的每对患者的中位数的表达差异**P（P）<0.01***P（P）<0.001.
图3。
图3。
UVB照射诱导人晶状体上皮SRA细胞Otx2的表达和细胞形态的改变。（A） 暴露于0、3、6和18剂量UVB的SRA细胞的代表性相位对照图像 毫焦耳/厘米2.比例尺：100µm。（B） 通过RT-qPCR定量UVB照射SRA细胞中Otx2的表达。（C） 18岁时UVB照射SRA细胞中Otx2蛋白的表达 毫焦耳/厘米2western blot分析。（D） 测量并绘制细胞的纵向和横向长度*P（P）<0.05, ***P（P）<0.001.
图4。
图4。
Otx2在SRA细胞中的过度表达改变了它们的细胞形态。（A） 用抗Otx2抗体（54倍于对照细胞）进行western blot分析Otx2-过表达SRA细胞（Otx2-OE）和对照细胞（Cont）的Otx2-1表达。western-blot中，每个样本中的β-actin表达用于负荷对照。（B） 图中显示了Otx2-过表达SRA细胞（Otx2-OE）和对照细胞（Cont）的代表性相控图像。在五个独立的实验中也得到了相同的结果。比例尺：100 微米。（C） 测量并绘制细胞的纵向和横向长度***P（P）<0.001.
图5。
图5。
Otx2-OE晶状体上皮细胞的上皮-间充质转化（EMT）。（A） Otx2-过表达细胞（Otx2-OE）和对照细胞（Cont）用抗纤维连接蛋白或抗α-SMA抗体（绿色）和核染色DAPI（蓝色）染色。比例尺：20 微米。（B） 在五个随机选择的图像中，测量并量化每个细胞面积的抗纤维连接蛋白和抗α-SMA信号的荧光强度。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。测量数据点用点表示，中间点用水平条表示。（C） RT-qPCR分析Otx2-OE细胞中TGFβ2 mRNA的表达。（D） western blot分析SMAD2（p-SMAD2）和3（p-Smad 3）的磷酸化。每个样本中Smad2/3和β-actin的表达用于western blotting中的负荷对照。用RT-qPCR分析Otx2-OE细胞中α-SMA（E）和γ-SMA（F）的（E，F）mRNA表达**P（P）<0.01***P（P）<0.001.
图6。
图6。
Otx2改变晶状体纤维分化培养中SRA细胞的基因表达。（A） SRA细胞在材料和方法部分描述的分化条件下培养10 用RT-qPCR检测第1天、第2天、第4天、第6天和第10天PROX1、CRYAA和DNASEIIB的mRNA表达。（B） Otx2-过表达细胞（Otx2-OE）和对照细胞（Cont）在相同分化条件下在A培养，并在第1天和第5天用RT-qPCR分析PROX1、CRYAA和DNASEIIB的mRNA表达*P（P）<0.05, **P（P）<0.01.
图7。
图7。
H的影响2O（运行）2对SRA细胞中Otx2表达和细胞形状的处理。（A） 用0、100和400处理SRA细胞 H的µM2O（运行）2PBS中30 H的最小代表性相位对比图像2O（运行）2-处理后的细胞在48 h后处理。比例尺：100µm。（B） 测量并绘制每个细胞的纵向和横向长度。（C） H的Otx2表达2O（运行）2-用RT-qPCR对处理后的细胞进行定量**P（P）<0.01***P（P）<0.001.
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