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.2019年2月7日；176（4）：757-774.e23。
doi:10.1016/j.cell.2018.12.038。 Epub 2019年1月31日。

肿瘤细胞肌球蛋白II的区域激活通过与免疫微环境的分泌性交叉对话促进肿瘤进展

米雷拉·乔治利 1, 塞西莉亚·赫拉伊斯 1, 伊娃·克罗萨斯·莫利斯特 2, 布鲁斯·范肖 三, 奥斯卡·梅克斯 2, 安娜·佩德里克斯 4, 帕希尼·潘迪亚 1, 艾琳·罗德里格斯-埃尔南德斯 2, 克里斯蒂娜·米利埃娃 5, 盖亚·坎泰利 1, 卡拉吉安人泛球虫 6, 西尔维娅·梅勒 5, 林和音 1, 黛布拉·约瑟夫斯 7, 泽维尔·马蒂亚斯·圭 8, 罗莎·马蒂 9, Frank O雀巢 5, 何塞·L·奥尔加斯 2, 伊拉里亚·马兰奇 10, 吉尔伯特·O·水果诞生 11, Sophia N Karagiannis公司 5, 维多利亚·桑兹·莫雷诺 12
附属机构

肿瘤细胞肌球蛋白II的区域激活通过与免疫微环境的分泌性交叉对话促进肿瘤进展

米雷拉·乔治利等。 单元格. .

摘要

ROCK-Myosin II在转移性传播过程中驱动癌细胞中快速的圆形运动体迁移。对人类黑色素瘤活检的分析表明，肌球蛋白II活性高的变形虫黑色素瘤细胞在靠近CD206的原发性肿瘤侵袭前沿占优势+CD163型+肿瘤相关的巨噬细胞和血管。蛋白质组分析表明，变形虫癌细胞中的ROCK-Myosin II活性控制免疫调节分泌体，使单核细胞得以招募并分化为促肿瘤巨噬细胞。变形虫癌细胞及其相关巨噬细胞都支持异常的血管系统，最终促进肿瘤进展。从机制上讲，变形虫癌细胞通过ROCK-Myosin II驱动的IL-1α分泌和NF-κB激活来维持其行为。使用一系列肿瘤模型，我们发现肿瘤细胞中的高肌球蛋白II活性重新编程固有免疫微环境以支持肿瘤生长。我们描述了肌球蛋白II动力学在癌细胞中通过分泌因子控制髓系功能的意外作用。

关键词：核因子-κB；岩石肌球蛋白II；巨噬细胞；蛋白分泌；圆形瘤样黑色素瘤细胞；肿瘤浸润前沿。

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数字

无
图形摘要
图1
图1
人类黑色素瘤的侵袭性前沿富含靠近巨噬细胞和血管的阿米巴黑色素瘤细胞（A）来自人类原发性黑色素瘤的匹配样本的瘤体黑色素瘤细胞形状评分（TB）或侵袭性前沿（IF）。值的范围从0（所有单元格圆形）到300（所有单元格纺锤形）。（B） （A）中患者p-MLC2染色的H评分。数值范围从0（无染色）到400（非常强烈的染色）。（C–F）（左）量化和（C）CD68的（右）代表图像+，（D）CD163+，（E）CD206+和（F）CD31+原发性黑色素瘤TB和IF中的细胞。（G） 原发性和转移性黑色素瘤的黑色素瘤细胞形态评分。（H和I）（左）量化和（H）CD206的（右）代表图像+和（I）CD31+原发性和转移性黑色素瘤中的细胞。（J） 原发性（n=68）和转移性（n=316）黑色素瘤中CD206的mRNA水平。原始数据来自TCGA。（K） 示意图：人黑色素瘤IF和转移部位。在（A）–（I）中，n=24个原发性和n=16个转移性黑色素瘤。比例尺，肿瘤核心200μm，所有聚焦图像50μm，除了（A）显示比例尺为5μm的分数的聚焦图像。所有数据均按患者显示。平均值取自每TB 4个肿瘤核心和每IF 4个肿瘤中心。在（A）–（F）中，列出了来自相同患者的匹配TB和IF。在（A）–（I）中，箱线图显示最小值到最大值。在（J）中，斑点杂交显示平均值±SEM。在（A）–（F）中，显示Wilcoxon配对签名秩检验。在（G）–（J）中，显示了t检验。*p<0.05，∗∗p<0.01，∗∗∗p<0.001，∗∗∗∗p<0.0001。另请参见图S1和表S3和S4。
图S1
图S1
人类黑色素瘤侵袭前沿在巨噬细胞和血管附近具有高肌球蛋白II活性的变形虫黑色素瘤细胞中富集，与图1（A）B组中肿瘤体（TB）或人类黑色素癌活检侵袭前沿（IF）中的黑色素瘤形状评分有关，值范围为0（所有细胞圆形）至300（所有电池芯轴）（另见STAR方法）（n=7）。（B–D）每个视野（FOV）下，（B）CD163+巨噬细胞、（C）CD206+巨噬细胞和（D）CD31+血管的平均数量（顶部）和代表性图像（下面），以TB或IF为单位。B组比例尺，50μm（CD163为n=4，CD206为n=5，血管为n=6）。（E） A组原发性和转移性黑色素瘤病灶中CD68+巨噬细胞和（F）CD163+巨噬细胞的平均数量。（G） 正常皮肤（黑色）、痣（青色）、原发性黑色素瘤（蓝色）、转移性黑色素瘤（红色）中CD31和CD206mRNA水平相关性散点图。Pearson的r.从公开数据库GEO获得的原始数据。（A、E和F）方框图显示最小值到最大值。（B–D）图表显示平均值±SEM。（A–D）配对t检验。（E和F）t试验。ns p>0.05，*p<0.05，∗∗p<0.01，***p<0.001。
图2
图2
黑色素瘤细胞中的肌球蛋白II活性有利于A375M2和A375P细胞中免疫调节因子（A）（上图）和（下图）p-MLC2水平的免疫印迹分泌。（B） CM A375M2中富集的分泌因子的热图与CM A375P相比增加了1.1倍，分为3组（0-300-、0-50-和0-5倍）。青色和红色分别表示最低和最高表达水平。（C） 通过ELISA测定CM A375P或CM A375M2中IL-1α、IL-10、TGF-β和IL-8的浓度（n=3）。（D） 在A375M2细胞中MLC2被敲除后，通过ELISA（n≥3，IL-1α、IL-8和TGF-β，n=2，IL-10）对p-MLC2水平进行（左）代表性免疫印迹，并对CM A375 M2中IL-1α，IL-10，TGF-α和IL-8分泌水平进行（右）标记。（E） 在A375M2细胞中ROCK1/2被敲除后，通过ELISA（n≥3，IL-1α和TGF-β，n=2，IL-10），对ROCK1/2和p-MLC2水平进行（左）代表性免疫印迹，并对CM A375 M2中IL-1α、IL-10和TGF--β的分泌水平进行（右）标记。（F） 在A375M2细胞中用H1152（5μM）处理48小时后，用ELISA（n≥3）（左）代表性免疫印迹法检测p-MLC2水平，（右）分泌IL-1α、IL-10、TGF-β和IL-8水平。（G） 通过ELISA检测WM983B和WM983A细胞中p-MLC2水平的图像和免疫印迹，以及CM WM983B、CM WM983A和CM WM88中TGF-β和IL-8的分泌水平（底部）（n=3表示全部，n=2表示CM WM88的IL-8）。（H） 在WM983B细胞中MLC2被敲除后，通过ELISA检测，（顶部）代表性免疫印迹检测p-MLC2水平，（底部）分泌TGF-β和IL-8水平（n=3）。（一） 用H1152（5μM）处理WM983B细胞48小时后，（顶部）代表性免疫印迹检测p-MLC2水平，（底部）分泌TGF-β和IL-8水平（n≥3）。在（D）–（F）、（H）和（I）中，数据表示为相对于对照的折叠变化。在（C）–（I）中，图表显示了平均值±SEM。在（G）中，显示了使用Tukey事后检验的单向方差分析。*p<0.05，∗∗p<0.01，∗∗∗∗p<0.0001。参见图S3和表S1。
图S2
图S2
黑色素瘤细胞中的肌球蛋白II活性有利于免疫调节因子的分泌，与图2（A）相关的图表显示了CM A375M2中影响促肿瘤炎症与抑肿瘤炎症平衡的因素。（B） （顶部）示意图显示了黑色素瘤进展中的分泌因子，（底部）热图显示了转移性黑色素瘤与黑色素细胞和转移性黑素瘤与原发性黑色素癌样本中IL-4、IL-8、IL-1α、TGF-β和IL-10 mRNA水平的倍变。原始数据来自TCGA和GEO数据库。（C） MLC2敲除后A375M2细胞中的相对p-MLC2和MLC2水平。（D） ROCK1/2敲除后A375M2细胞中的相对ROCK1、ROCK2、p-MLC2和MLC2水平。（E） Y27632（10μM）或GSK269962A（5μM）处理48小时（n≥3）后，CM A375M2细胞分泌IL-1α、IL-10、TGF-β和IL-8。数据显示为相对于对照的折叠变化。（F） （左）用LIMKi 3（1μM）处理48小时（n=3）后，A375M2细胞中p-cofilin和（右）相对p-cofillin水平的代表性免疫印迹。（G） 接种在I型胶原顶部的A375M2细胞的圆形指数，用H1152（5μM）、Blebbistatin（2.5μM）或LIMKi 3处理48小时（n=3）。（H） 用H1152或LIMKi 3处理48小时的A375M2细胞中p-MLC2的代表性免疫印迹和p-MLC2水平的（右）定量（n=3）。（一） CM A375M2+H1152、CM A375M2+Blebbistatin或CM A375M2+LIMKi 3中IL-1α、IL-10和IL-8的分泌水平。数据显示为与对照组相比的倍数变化（IL-10和IL-8的n≥3，IL-1α的n≥2）。（J） （左）用H1152（5μM）处理48小时（n≥3）后，WM793B细胞中p-MLC2水平的代表性免疫印迹和（右）WM793B细胞分泌TGF-β和IL-8的水平。（C-J）图形和斑点印迹显示平均值±SEM。（C、D和F–J）t检验。（E） Tukey事后检验的单向方差分析。ns p>0.05，*p<0.05，∗∗p<0.01，∗∗∗p<0.001，∗∗∗∗p<0.0001。
图3
图3
变形虫黑色素瘤细胞诱导促肿瘤巨噬细胞（A）向培养基（–）、CM A375P或CM A375M2（n=3）迁移的人PBMC衍生单核细胞、THP-1和U937的百分比。（B） （左）示意图：体外-极化巨噬细胞或黑色素瘤调节巨噬细胞和（右）%CD163+CD206型+或%HLA-DR+CD86型+用M-CSF、IL-4、IL-10、IFN-γ和LPS或仅培养基（-）治疗后的巨噬细胞（n=5；5个不同的健康供体）。（C） 一位供体的荧光激活细胞分选（FACS）点图显示（左）%CD163+CD206型+和（右）%HLA-DR+CD86型+仅用CM A375P、CM A375M2或培养基处理后的巨噬细胞（–）。（D–F）%CD163+CD206型+巨噬细胞（D）、CD206（E）的平均荧光强度（MFI）和%HLA-DR+CD86型+巨噬细胞（F），用CM A375P、CM A375M2或仅培养基（-）处理后（n=5；5个不同的健康供体）。（G） 巨噬细胞形态定量（见图S3D）（n=3；3个不同的健康供体）。（H） 示意图显示巨噬细胞细胞毒性试验。（一） 与经CM A375M2或干扰素-γ和脂多糖处理的PBMC衍生单核细胞共培养的死亡肿瘤细胞（A375 M2或WM88）的折叠变化。数据显示为与对照组未经处理的单核细胞相比的折叠变化。Log2量表以y轴表示（n=6；A375M2共培养的6名不同健康供体，n=2；WM88共培养的2名不同健康供者）。（J） （顶部）示意图显示TAM感应在体外黑色素瘤患者的血清和（底部）一位捐赠者的代表性FACS点图显示%CD163+CD206型+和%HLA-DR+CD86型+用健康志愿者血清或黑色素瘤患者血清治疗后的巨噬细胞。（K和L）（K）CD163的数量+CD206型+和（L）HLA-DR+CD86型+用健康志愿者血清或黑色素瘤患者血清治疗后的巨噬细胞（n=3；3个不同的健康供体。n=10名健康志愿者的血清，n=23名黑色素瘤病人的血清，每个点代表不同的治疗）。在（A）、（B）、（D）–（G）、（I）、（K）和（L）中，图形和斑点印迹显示平均值±SEM。在（A。在（I）中，显示了t检验。在（K）和（L）中，显示了带有韦尔奇修正的t检验。无显著性p>0.05，*p<0.05，∗∗p<0.01，***p<0.001，∗∗∗∗p<0.0001。另请参见图S3以及表S1和S2。
图S3
图S3
高肌球蛋白II活性的变形虫黑色素瘤细胞诱导肿瘤促生巨噬细胞，与M-CSF（50ng/ml）、IL-4（20ng/ml或仅培养基（-）（n=5；5个不同的健康供体）。（B和C）（B）CD163、（C）HLA-DR和CD86在经CM A375P或CM A375M2处理的巨噬细胞或仅在培养基（-）中的表达水平（gMFI）（n=5；5个不同的健康供体）。（D） 使用M-CSF、IL-4、IL-10、IFN-γ和LPS或仅使用培养基处理的巨噬细胞的典型亮场图像（-）。蓝色和红色箭头分别表示“fried-egg”和拉长形状。比例尺，50μm。（E） 与CM A375M2或IFN-γ和LPS刺激的巨噬细胞共同培养后的死亡肿瘤靶点（WM1366、WM793B、WM3854和WM983A）。数据显示为与对照组未经处理的单核细胞相比的折叠变化。对数2刻度以y轴表示。（F和G）SCID小鼠（n=6只小鼠PBS组和n=5只小鼠clodronate组）通过氯膦酸盐耗竭巨噬细胞后，（F）A375M2异种移植和（G）WM983B异种移植的肿瘤体积。（H） 典型的IHC图像显示A375M2和WM983B异种移植物中注射氯膦酸盐后F4/80+和CD206+巨噬细胞耗竭。比例尺，100μm。（A-C和E-G）图显示平均值±SEM。（A-C）单向方差分析（带Tukey事后检验）。（F和G）双向方差分析与Bonferroni的多重比较试验。ns p>0.05，*p<0.05，∗∗p<0.01，∗∗∗p<0.001，∗∗∗∗p<0.0001。
图4
图4
AATME成分是黑色素瘤的保守特征在体内（A） EGFP-A375P和EGFP-A355M2细胞中p-MLC2（青色）和F-actin（红色）的共焦图像。（B） 注射EGFP-A375P和EGFP-A355M2细胞后异种移植物的肿瘤体积（n=8只小鼠/组）。（C） p-MLC2水平的免疫组织化学（IHC）图像（标尺，50μm；插入，10μm）。（D） p-MLC2水平的（顶部）IHC量化显示了距IF（0–2 mm）不同距离处得分最高的黑色素瘤细胞百分比（4），以及A375P和A375M2肿瘤的p-MLC2染色的（底部）H得分（n=8只小鼠/组）。（E） CD206的代表性IHC图像+巨噬细胞（标尺，30μm，插入物：10μm）。（F–H）（F）CD206的定量+，（G）F4/80+和（H）CD31+A375P和A375M2肿瘤中的细胞（n＝8只小鼠/组）。（C） –（H）对应于IHC测试的A375P和A375M2异种移植物的TB和IF（n=8只小鼠/组）。（一） EGFP-WM983A和EGFP-WM983B细胞中p-MLC2（青色）和F-actin（红色）的共焦图像。（J） 注射EGFP-WM983A和EGFP-WM983B细胞后异种移植物随时间（35天）的肿瘤体积（n＝8只小鼠/组）。p-MLC2染色（K）的（K–M）H评分，CD206的量化+（五十） 和F4/80+经IHC检测，WM983A和WM983B异种移植物的TB和IF中的巨噬细胞（M）（n=8只小鼠/组）。p-MLC2（N）的（N和O）H评分和CD206的量化（O）+IHC检测B16F10肿瘤的TB和IF中的巨噬细胞（n=8只小鼠）。（P和Q）（左）IHC图像和（右）H-score用于P-MLC2染色（P），（左）IHC图像以及（右）CD206定量+5555个肿瘤（n=5个肿瘤）的结核和IF中的巨噬细胞（Q）。比例尺，30μm。在（B）、（D，顶部）和（J）中，图表显示平均值±SEM。在（D，底部）、（F）–（H）和（K）–（Q）中，箱线图显示10-90%。在（B）、（D，顶部）和（J）中，显示了使用Bonferroni事后检验的双向方差分析。在（D，底部）、（F）–（H）和（K）–（M）中，显示了使用Tukey事后检验的单向方差分析。在（N）-（Q）中，显示了t检验。无显著性p>0.05，*p<0.05∗∗，p<0.01，∗∗∗p<0.001，∗∗∗∗p<0.0001。另请参见图S4。
图S4
图S4
AATME成分是黑色素瘤的保守特征在体内，与图4（A）（左）圆度指数和（右）p-MLC2水平/面积有关，在接种于胶原蛋白I顶部的EGFP-A375P和EGFP-A355M2细胞中。定量对应于由细胞总面积归一化的p-MLC2染色所占据的面积。（B） A375P和A375M2肿瘤的TB和IF中的黑色素瘤细胞形状评分（n=8只小鼠/组）。（C） IHC测试的A375P和A375M2肿瘤在不同距离IF（0-2 mm）处p-MLC2得分为0-4的黑色素瘤细胞百分比（n=8只小鼠/组）。（D） （左）接种在胶原蛋白I顶部的EGFP-WM983A和EGFP-WM983B细胞的圆度指数和（右）p-MLC2水平/面积。（F） WM983A和WM983B肿瘤在距离IF（0-2 mm）不同距离处p-MLC2评分为0-4的黑色素瘤细胞百分比（n=8只小鼠/组）。（G） 根据IHC的测试，在距离WM983A和WM983B肿瘤IF（0-2 mm）不同距离处，p-MLC2得分为4的黑色素瘤细胞百分比（n=8只小鼠/组）。（H） （左）A375P细胞与A375M2细胞的增殖率，（右）WM983A细胞与WM983B细胞的增殖速率。数据显示为与第0天相比的倍数变化。（一） 示意图显示了从A375M2肿瘤的TB或IF中分离出的黑色素瘤细胞。（J） 用ELISA测定从A375M2肿瘤的结核或IF分离的黑色素瘤细胞中分泌的IL-10的浓度（n=3）。（K） 用CM治疗后，从A375M2肿瘤的TB或IF分离的黑色素瘤细胞中CD163+CD206+巨噬细胞的百分比（n=2；2个不同的健康供体；2个匹配的TB/IF样本；1对与2个不同供体一起使用两次）。B16F10肿瘤的TB和IF中的（L和M）（L）黑色素瘤细胞形状和（M）F4/80+巨噬细胞（n=8只小鼠）。（N） 肿瘤TB和IF中的黑色素瘤细胞形态评分和（O）F4/80+巨噬细胞在皮内注射Venus-5555细胞（N=5个肿瘤）8天后生成。（A左、D左、G和H）图表和斑点显示平均值±SEM。（A右、B、D右、E和L–O）方框图显示10-90%。（A、D、H、J、L–O）t试验。（K） 成对的，成对的t吨-测试。（B和E）采用Tukey事后检验的单向方差分析。（G） 采用Bonferroni事后检验的双向方差分析。ns p>0.05，*p<0.05，∗∗p<0.01，∗∗∗p<0.001，∗∗∗∗p<0.0001
图5
图5
阻断黑色素瘤细胞重编程巨噬细胞中肌球蛋白II活性（A）示意图：在体外用来自ROCK抑制或MLC2缺失的A375M2细胞的CM处理PBMC-derived单核细胞以及随后的分析。（B） CD163型+CD206型+用CM A375M2、CM A375M2+ROCKi或仅培养基（–）处理PBMC衍生单核细胞后的巨噬细胞（n=8；8个不同的健康供体；每个点是不同的供体）。（C） 用CM A375M2处理PBMC衍生的单核细胞，从MLC2中去除并量化CD163+CD206型+巨噬细胞。数据表示为折叠变化与控制（n=4）。（D） 吸光度倍数变化（O.D.）的量化：内皮细胞（HMVECs和HUVECs）经巨噬细胞衍生上清液（50%）处理后的活性。培养基来自单核细胞±CM A375M2+ROCKi（HMVEC n≥3，HUVEC n=6）。用巨噬细胞衍生上清液处理内皮细胞72小时（E）示意图：体内用GSK269962A ROCKi预处理的5555细胞进行实验。（F） p-MLC2的代表性H&E图像（顶部）和IHC图像显示，皮内注射DMSO（载体）预处理5555细胞14天后，肿瘤IF中的变形虫黑色素瘤细胞具有高p-MLC2侵袭真皮。比例尺，50μm；插入物，10μm。（G–I）侵袭黑色素瘤细胞数量（G）、圆度指数（H）和p-MLC2的H评分（I）（G）。（J） （左）CD206+和（右）F4/80+皮内注射后14天，DMSO（载体）预处理或ROCKi预处理静脉-5555细胞IF.（G–J）肿瘤中的巨噬细胞（n=14个对照组，n=12个ROCKi）。（K） PBS或Y27632 ROCKi处理的A375M2异种移植物的肿瘤体积。CD206的（L–N）黑色素瘤细胞形态评分（L）和定量（M）+和（右）F4/80+和（N）CD31+用PBS或Y27632 ROCKi（n≥4）处理的A375M2异种移植物中的细胞。在（B）–（D）、（G）、（H）和（K）中，图形和斑点杂交显示平均值±SEM。在（I）、（J）和（L）–（N）中，箱线图显示10–90%。在（B）和（L）–（N）中，显示了Tukey事后检验的单因素方差分析。在（C）和（G）–（J）中，显示了t检验。在（D）中，显示了Kruskal-Wallis检验和Dunn的多重比较检验。在（K）中，显示了Bonferroni事后检验的双向方差分析。无显著性p>0.05，*p<0.05，∗∗p<0.01，∗∗∗p<0.001，∗∗∗∗p<0.0001。另请参见图S5。
图S5
图S5
操纵肌球蛋白II活性后AATME的重塑在体内与图5（A–D）相关，经CM A375M2、CM A375M2+H1152、CM B375M2+Y27632、CM A375 M2+GSK269962A或仅培养基（-）（n≥5个不同健康供体）处理后，巨噬细胞中（A）CD163、（B）CD206、（C）HLA-DR和（D）CD86的表达水平（gMFI）。（E） 用H1152、Y27632或GSK269962A ROCK抑制剂处理的A375M2细胞中的相对p-MLC2水平（n=4）。（F） 用CM A375M2从MLC2中去除后的HLA-DR+CD86+巨噬细胞。数据表示为与对照组相比的折叠变化（n=4）。（G和H）。（一） 黑色素瘤患者衍生血清或健康志愿者衍生血清诱导巨噬细胞中IL-10的浓度（n=2；2个不同的健康巨噬细胞供体；n=5个志愿者衍生血清和n=9个黑色素瘤病人衍生血清）。（J） 用CM A375M2、CM A375M3+H1152或CM A375M2+GSK269962A处理后，巨噬细胞吞噬酵母多糖颗粒的MFI，含或不含细胞松弛素D（5μM）（n=2）。（K） 皮内注射DMSO（载体）-预处理和ROCKi-预处理的Venus-5555细胞（n=5只小鼠/组）8天后，TB中黑色素瘤细胞和IF中（L）（左）CD206+巨噬细胞和（右）F4/80+巨噬细胞p-MLC2表达的H评分。（M） 可存活的二甲基亚砜（载体）-预处理和ROCKi-预处理Venus-5555细胞的百分比在体外由孵化器测量（n=3）。药物去除后测定生存能力。（N） 肿瘤体积（mm三)在C57BL/6J小鼠皮内注射DMSO（载体）-预处理和ROCKi-预处理的Venus-5555细胞（天数：0-14）（DMSO组13个肿瘤，ROCKi组14个肿瘤；n=7只小鼠/组）。（A–J、M和N）图显示平均值±SEM。（K–L）箱线图显示10-90%。（A-E、J和K）采用Tukey事后检验的单向方差分析。（F–H和L）t试验。（一） 用韦尔奇的修正进行测试。（N） 采用Bonferroni事后检验的双向方差分析。ns>0.05，*p<0.05，∗∗p<0.01，∗∗∗p<0.001，∗∗∗∗p＜0.0001。
图6
图6
黑色素瘤细胞中的肌球蛋白II活性通过分泌的IL-1α诱导的NF-κB激活而自我维持（A和B）（上）图像、（中）圆度指数和（下）用CM A375P或CM A375M2处理后I型胶原顶部的（A）A375P细胞和用BFA处理6小时后（B）A375M2细胞的相对p-MLC2水平。数据表示为与对照组相比的折叠变化（n=3）。（C） A375M2细胞上调因子的MetaCore富集网络以NF-κB为中心。（D） （顶部）用CM A375P或CM A375M2处理的A375P细胞中p-IKBα水平的免疫印迹和（底部）定量。数据显示为与CM A375M2治疗相比的折叠变化（n=3）。（E和F）MLC2敲除后A375M2细胞中p-IKBα水平的免疫印迹（E）和定量（F）。数据表示为折叠变化与控制（n=2）。（G） A375P和A375M2细胞中核p65的共焦图像和（底部）量化（以百分比表示）。每个点代表一个不同的单元格。比例尺，10μm。（H） （上图）用CM A375P或CM A375M2处理后A375P细胞p65的共焦图像。比例尺，10μm。（底部）经指定处理后，细胞质（绿色）、细胞核（红色）或两者（橙色）中p65的A375P细胞百分比。在37°C下封闭1小时（n=3；每次实验3张图片；每个条件总共9张图片）。（一） 经与（H）相同的处理后，I型胶原上A375P细胞的圆度指数（n=3）。（J） NFKB1缺失的A375M2细胞中p-MLC2和F-actin的共焦图像。比例尺，20μm。（K） NFKB1敲除后A375M2细胞的（左）圆度指数和（右）相对p-MLC2水平，来自共聚焦图像（30个细胞/条件，每个点代表一个细胞）。（K右下角）代表性免疫印迹显示NFKB1在A375M2细胞中被击倒。（五十） 示意图：变形虫黑色素瘤细胞中ROCK-Myosin II、分泌的IL-1α和NF-κB激活之间的相互作用。在（A，中心）和（B，中心）中，箱线图显示了10-90%。在（A，底部）和（B，底部）、（D）、（F）–（I）和（K）中，图形和斑点印迹显示平均值±SEM。在（A）、（B）、（D）、（F）和（G）中，显示t检验。在（H）、（I）和（K）中，显示了使用Tukey事后检验的单向方差分析。*p<0.05，∗∗p<0.01，∗∗∗p<0.001，∗∗∗∗p<0.0001。另请参见图S6。
图S6
图S6
通过分泌IL-1α诱导的NF-κB活化，癌症细胞中的肌球蛋白II活性自我维持，与图6（A）（上图）相关示意图说明了CM A375M2对A375P细胞的治疗，以及CM A375M治疗后A375P中p-MLC2的（下图）代表性免疫印迹。（B） 用CM A375P、CM A375M2或仅用培养基处理后迁移的A375P细胞的百分比（-）。与CM A375M2治疗（n≥3）相比，给出了数据。（C） 用BFA处理6h后，对A375M2细胞中的p-MLC2进行代表性免疫印迹。（D） 用CM A375P、CM A375M2、IgG2α阻断的CM A375M、IL-1α阻断的CMA375M 2、IgG1阻断的CM B375M2或IL-8阻断的CMA A375M2.处理A375P细胞后，分别显示p65定位和细胞形态的典型共聚焦图像和（底部）明场图像。在37°C下封闭1h。比例尺，共焦图像为10μm，亮场图像为20μm。（E） NFKB1敲低后A375M2细胞中的相对NFKB1水平。（F） IKKβ抑制剂治疗A375M2细胞后p-IκBα的代表性免疫印迹。（G） 用IKKβ抑制剂处理后A375M2细胞的圆度指数和（H）相对p-MLC2水平。（I） 在用ROCKi H1152（5μM）处理1小时、2小时、4小时或24小时后，接种在牛胶原蛋白I上的A375M2细胞中，圆形指数（n=3）、（J）代表性亮场图像和（K）p-MLC2的代表性免疫印迹。（五十） 接种在牛I型胶原上的A375M2细胞经IKKβ抑制剂IKK？Ⅲ（0.5μM）处理1h、2h、4h或24h后，其圆度指数（n=3）、（M）代表性亮场图像和（n）代表性免疫印迹中的p-MLC2。（B、E和H）图表和斑点印迹显示平均值±SEM。（G、I和L）方框图显示10-90%。（B、E、I和L）Tukey事后检验的单向方差分析。（G和H）t试验。*p<0.05，∗∗p<0.01，∗∗∗p<0.001，∗∗∗∗p<0.0001。
图S7
图S7
通过变形虫黑色素瘤细胞分泌的转移定植，与图7（A）相关，THP-1细胞从NFKB1缺失的A375M2细胞（n=4）迁移到CM A375M2或CM。（B） 用来自MLC2-depleted或NFKB1缺失的A375M2细胞的CM治疗后巨噬细胞CD206的gMFI（n=4）。（C） （上图）显示使用CM A375P或CM A375M2治疗内皮细胞的示意图。（下图）CM A375P或CM A375M2治疗后HMVEC中VE-cadherin（绿色）、F-actin（红色）和DAPI（蓝色）免疫染色的典型共焦图像。虚线表示间隙。比例尺，40μm。（D） CM A375P或CM A375M2（n≥3）治疗后HMVEC单层破裂面积（顶部）和VE-cadherin结合指数（底部）的量化。（E） 表格显示了在细胞骨架磷酸抗体阵列中发现的最上调的磷酸蛋白。将CM A375M2处理的HMVEC（s1）与来自ROCK1/2缺失的A375M2细胞（s2）的CM处理HMVEC细胞进行比较。数值表示为比值变化s1/s2。比值=（磷化氢位点特异性抗体的信号强度）/（位点特异性抗体的信号密度）。结果以不同深浅的红色突出显示，表示最高表达水平。当值>2时，折变增加被视为显著。（F） CM A375P或CM A375M2处理的HMVEC汇合单层的渗透性百分比（左）和CM A375M2+H1152或CM A375 M2+Y27632处理的HMVeC汇合层的渗透性百分数（n≥3）。（G） A375P细胞、A375M2±H1152或±Y27632细胞（n≥3）中的相对p-MLC2水平。（H） 用CM A375M2（-）处理的HUVEC汇合单层的渗透性百分比或来自ROCK1/2完整A375M2.的CM。数据显示为相对于对照的折叠式变化（n=3）。（A、B、D和F–H）图形和斑点印迹显示平均值±SEM。（A、D、F左和H）t检验。（右）克鲁斯卡尔·沃利斯和邓恩的多重比较。（B和G）采用Tukey事后检验的单向方差分析。*p<0.05，∗∗p<0.01，***p<0.001。
图7
图7
变形虫性黑色素瘤细胞中NF-κB与ROCK-Myosin II的交叉对话培养肿瘤微环境（A）（上图）示意图：指定治疗后的巨噬细胞表型。（左下）A375M2细胞中MLC2或NFKB1击倒后p-MLC2的免疫印迹。（右下）CD163的百分比+CD206型+巨噬细胞用NFKB1缺失或MLC2缺失的A375M2细胞的CM处理PMBC-derived单核细胞，±IL-4（n=4）。（B） （上图）示意图：内皮细胞在指定条件下的治疗和下游分析。（底部）指定治疗后HMVEC中VE钙粘蛋白（绿色）、F-肌动蛋白（红色）和DAPI（蓝色）免疫染色的共聚焦图像。虚线表示间隙。比例尺，40μm。（C） （左）指示条件下的相对p-MLC2水平（n≥3）。（右上）HMVEC在指定治疗（n≥2）后单层破裂面积和（右下）VE-cadherin结合指数的量化。（D） 热图显示，CM A375M2±siROCK1/2处理的HMVEC中调节内皮通透性的蛋白表达发生了翻倍变化。蓝色和红色分别表示最高和最低表达水平（6个重复/抗体）。（E） 在指定条件（n≥3）下处理的HMVEC的渗透率（与对照组相比）。（F） A375M2±siROCK1/2的p-MLC2、ROCK1和ROCK2免疫印迹。（G） （左）尾静脉注射5-氯甲基荧光素二乙酸酯（CMFDA）-绿色标记A375M2±siROCK1/2和右旋糖酐（紫色）后小鼠肺部的共焦图像，以及右旋糖苷覆盖的视野面积百分比（20个视野/小鼠/条件）。（H） （左）来自（G）和（右）细胞覆盖的视野面积百分比的小鼠肺部共焦图像（20个视野/小鼠/条件）。标尺in（G）和（H），100μm。在（G）和（H）中，每个实验的n=5只小鼠/条件，n=2个独立实验。在（A）、（C）和（E）中，图形和斑点杂交显示平均值±SEM。在（G）和（H）中，箱线图显示最小值到最大值。在（A）、（C）和（E）中，显示了单向方差分析和Tukey事后检验。在（G）和（H）中，显示了t测试。*p<0.05，∗∗p<0.01，∗∗∗∗p<0.0001。另请参见图S7。
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