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.2019年4月;23(4):2475-2488.
doi:10.1111/jcmm.14121。 Epub 2019年2月1日。

MiR-139-5p、MiR-940和MiR-193a-5p通过靶向SPOCK1抑制肝细胞癌的生长

附属公司

MiR-139-5p、MiR-940和MiR-193a-5p通过靶向SPOCK1抑制肝细胞癌的生长

彭丽等。 细胞与分子医学杂志. 2019年4月.

摘要

本研究旨在筛选出肝细胞癌(HCC)中差异表达的miRNA,并探讨这些miRNA及其靶基因的表达对HCC细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。通过微阵列分析筛选出肝癌中差异表达的miRNA。通过分析这三个miRNA的靶基因图谱(从Targetscan获得),筛选出这些miRNA的共同靶基因(miR-139-5p、miR-940和miR-193a-5p)。通过定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)测定miRNAs和SPOCK1的表达水平。通过双荧光素酶报告基因分析和RNA下拉分析验证了目标关系。通过3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2-氢四氮唑溴化铵、噻唑蓝四氮唑溴化物(MTT)和跨阱分析及流式细胞术,检测肝癌细胞活力、侵袭力和凋亡。在裸鼠体内进行实验,研究三种miRNA对肿瘤生长的影响。在HCC中发现miR-139-5p、miR-940和miR-193a-5p的下调。这些miRNAs的过度表达抑制了肝癌细胞的生存能力和侵袭力,促进了细胞凋亡并抑制了肿瘤生长。SPOCK1是miR-139-5p、miR-940和miR-193a-5p的共同靶基因,在肝癌中过度表达。SPOCK1过度表达促进肝癌细胞的增殖和侵袭,并抑制其凋亡。MiR-139-5p、MiR-940和MiR-193a-5p通过靶向SPOCK1抑制肝癌的发展。

关键词:聚光灯1;肝细胞癌;miR-139-5p;miR-193a-5p;miR-940。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人确认,不存在利益冲突。

数字

图1
图1
肝细胞癌(HCC)组织和HepG2细胞中的MiR‐139‐5p、MiR‐940和MiR‐)193a‐5p下调。A、 火山图反映了折叠变化>2和P(P)HCC组织中,包括miR-139-5p、miR-940和miR-193a-5p,<0.05。B、 热图反映了肝癌组织中miR-139-5p、miR-940和miR-193a-5p的低表达。NL为NL组织,HCC为HCC组织。(C) qRT-PCR检测到46例肝癌组织中miR-139-5p、miR-940和miR-193a-5p的相对表达显著低于46例匹配的邻近组织。N为邻近组织,T为HCC组织。D、 qRT-PCR检测到HepG2和Hep3b细胞中miR-139-5p、miR-940和miR-193a-5p的相对表达显著低于HL-7702细胞。E、 TCGA‐LIHC数据库中高miR‐139‐5p表达和低miR‐139‐5p表达患者总生存率的Kaplan‐Meier曲线分析。F、 TCGA‐LIHC数据库中miR‐940高表达和低表达患者的总体生存率的Kaplan‐Meier曲线分析。G、 TCGA‐LIHC数据库中miR‐193a‐5p高表达和miR‐的mi‐193 a-5p低表达患者的总体生存率的Kaplan‐Meier曲线分析。N为邻近组织,T为HCC组织*P(P) < 0.05, **P(P)与邻近组织或正常HL‐7702细胞系相比<0.01
图2
图2
MiR-139-5p、MiR-940和MiR-193a-5p抑制HepG2细胞的生长和侵袭。A、 分别用miR-139-5p拟态、miR-940拟态和miR-193a-5p拟态转染后,肝细胞癌细胞HepG2中miR-139-5、miR-94和miR-93a-5p的相对表达升高。(B,C)在miR-139-5p、miR-940和miR-193a-5p组中,通过MTT法检测到的HepG2细胞的细胞活力和通过transwell法检测出的侵袭细胞数量降低。D、 miR-139-5p、miR-940和miR-193a-5p组中通过流式细胞术检测到的HepG2细胞总凋亡率增加**P(P) < 0.01, ***P(P)与NC组相比<0.01
图3
图3
MiR-139-5p、MiR-940和MiR-193a-5p抑制Hep3b细胞的生长和侵袭。A、 qRT‐PCR用于评估转染后miRNAs的表达。B、 MTT法检测细胞活力。C、 通过穿孔实验检测细胞的侵袭能力。D、 流式细胞术检测Hep3b细胞的总凋亡率**P(P) < 0.01, ***P(P)与NC组相比<0.01
图4
图4
SPOCK1在肝细胞癌(HCC)组织和HepG2细胞中上调。A、 通过Venn图选择了11个miR‐139‐5p、miR-940和miR-193a‐5p的共同靶基因。(B)聚光灯1,GDE1,TRAF3号机组标签1是miR-139-5p、miR-940和miR-193a-5p的共同靶基因。C、 根据RNA下拉分析,Bio‐聚光灯1探针都增加了*P(P)与Bio‐NC‐探针相比<0.05。D、 相对mRNA表达斯波克1qRT-PCR在肝癌组织中检测到的阳性率较高**P(P)与正常组织相比<0.01。E、 western blot检测到肝癌组织中SPOCK1的相对蛋白表达较高**P(P)与正常组织相比<0.01。F、 相对mRNA表达聚光灯1qRT‐PCR检测到的HepG2和Hep3b细胞系中较高**P(P)与正常HL‐1107细胞系相比<0.01。G、 western blot检测到SPOCK1在HepG2和Hep3b细胞系中的相对蛋白表达较高**P(P)与正常HL‐1107细胞系相比<0.01。H、 相对mRNA表达聚光灯1miR-139-5p/miR-940/miR-193a-5p过度表达后,qRT‐PCR检测到的细胞数量减少*P(P) < 0.05, **P(P)与NC组相比<0.01。一、 miR-139-5p/miR-940/miR-193a-5p过度表达后,western blot检测到的SPOCK1的相对蛋白表达降低*P(P)<0.05时**P(P)与NC组相比<0.01。J、 Kaplan‐Meier曲线分析聚光灯1表达和低聚光灯1TCGA‐LIHC数据库中的表达式。
图5
图5
聚光灯1是miR-139-5p、miR-940和miR-193a-5p的共同靶基因。A、 相关分析表明,miR‐139‐5p的表达与聚光灯1级别。B、 相关分析表明,miR‐940的表达与聚光灯1级别。C、 相关分析表明,miR‐193a‐5p的表达与斯波克1级别。D、 根据双荧光素酶报告子分析聚光灯1WT+miRNA模拟物(miR-139-5p模拟物、miR-940模拟物和miR-193a-5p模拟物)组显著减少,而聚光灯1‐MUT+miRNA模拟物组无显著差异**P(P)与NC+SPOCK1‐WT组相比,<0.01。
图6
图6
聚光灯1促进HepG2细胞的生长和侵袭。A、 的相对表达式聚光灯1在通过qRT-PCR检测到的HCC细胞中聚光灯1组,si‐减少聚光灯1组,与NC组在聚光灯1+miRNAs(miR-139-5p、miR-940和miR-193a-5p)组。(B,C)使用蛋白质印迹来评估SPOCK1蛋白的表达。MTT法检测到HepG2细胞的(D,E)细胞存活率和transwell法检测到的侵袭细胞数量在聚光灯1组,si‐减少聚光灯1组,几乎保持不变聚光灯1+miRNAs(miR-139-5p、miR-940和miR-193a-5p)组。F、 流式细胞术检测到HepG2细胞的总凋亡率在聚光灯1组,si‐增加聚光灯1组,而在聚光灯1+miRNA(miR‐139‐5p、miR‐940和miR‐193a‐5p)组*P(P) < 0.05, **P(P)与NC组相比<0.01
图7
图7
聚光灯1促进Hep3b细胞的生长和侵袭。A、 qRT‐PCR用于检测聚光灯1.B,用MTT法检测Hep3b细胞的细胞活力。C、 Transwell分析显示Hep3b细胞具有侵袭能力。D、 流式细胞术检测Hep3b细胞的凋亡率
图8
图8
MiR-139-5p、MiR-940和MiR-193a-5p抑制体内肿瘤生长。(A,B)miR-139-5p、miR-940和miR-193a-5p组裸鼠肝肿瘤的体积和重量显著降低。C、 4周后从处死的裸鼠中取出肿瘤。NC组肿瘤明显大于miRNAs组。(D,E)相对聚光灯1在miR‐139‐5p、miR‐940和miR‐193a‐5p组中,通过qRT-PCR检测到的mRNA表达和通过蛋白质印迹检测到的蛋白质表达降低*P(P)与NC组相比,<0.05。F、 在miR-139-5p、miR-940和miR-193a-5p组中,通过western blot检测到的相对增殖标记物(包括PCNA和Ki67表达)减少。G、 miR-139-5p、miR-940和miR-193a-5p组通过western blot检测到的相对EMT标记物E-cadherin增加,N‐cadherin和Vimentin表达降低。H、 miR-139-5p、miR-940和miR-193a-5p组中通过western blot检测到的相关细胞凋亡调节因子包括caspase 3、caspase 7和caspase 8增加

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引用人

工具书类

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