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.2019年3月4日；216(3):688-703.
doi:10.1084/jem.20180765。 Epub 2019年2月1日。

异型CAF肿瘤球体促进卵巢癌早期腹膜转移

高庆雷 1, 杨宗元 2, 徐森（Sen Xu） 2, 李晓婷 2, 辛阳 2, 平津 2, 刘毅（音） 2, 周晓水 2, 张陶然 2, 成功 2, 肖伟 2, 刘丹（Dan Liu） 2, 朝阳太阳 2, 陈刚（音译） 2, 胡俊波 2, 李蒙 三, 周建峰 三, Kenjiro Sawada先生 4, 罗伯特·弗鲁西奥 5 6, 托马斯·W·格伦特 7, 约格·维希胡森 8, Víctor Manuel Vargas Hernández公司 9, 巴瓦娜·波图里 10, 罗伯特·L·科尔曼 11
附属机构

异型CAF肿瘤球体促进卵巢癌早期腹膜转移

高庆雷等。 实验医学杂志. .

勘误表in

  • 更正：异型CAF肿瘤球体促进卵巢癌的早期腹膜转移。
    高Q、杨Z、徐S、李X、杨X、金P、刘Y、周X、张T、龚C、魏X、刘D、孙C、陈G、胡J、孟L、周J、萨瓦达K、弗鲁西奇R、格伦特TW、维奇胡森J、瓦尔加斯·埃尔南德斯VM、波图里B、科尔曼RL。 高清等。 《实验医学杂志》，2019年10月7日；216(10):2448. doi:10.1084/jem.2018076508222019c。 《实验医学杂志》2019年。 采购管理信息：31591188 免费PMC文章。 没有可用的摘要。

摘要

高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）的特点是腹膜播散早，这与低级别浆液型卵巢癌（LGSOC）不同。在这里，我们描述了以整合素α5为特征的HGSOC腹水肿瘤细胞（ATCs）的侵袭性高的（ITGA5高的)ATC，容易与成纤维细胞形成异型球体。我们将这些聚集物称为HGSOC中的转移单位（MU），因为它们具有良好的转移能力，并积极参与早期腹膜播散。有趣的是，MU内的成纤维细胞支持ATC生存并引导其腹膜浸润，然后成为新形成转移瘤中肿瘤基质的重要组成部分。癌相关成纤维细胞（CAF）招募ITGA5高的ATC形成MU，MU通过EGF分泌进一步维持ATC ITGA5的表达。值得注意的是，LGSOC在很大程度上缺乏CAFs和由此产生的MUs，这可能解释了其转移延迟。这些发现确定了一种特殊的MU结构，该结构可放大肿瘤-基质相互作用并促进HGSOC的跨腔转移，为以基质成纤维细胞为导向的干预措施阻止OC腹膜增殖提供了基础。

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数字

无
图形摘要
图1。
图1。
在HGSOC患者中，ATC比相应的ATC更具粘附性和侵袭性。（A）描述了基于EpCAM微芯片的磁分选方案，用于对来自原发性肿瘤、腹水和HGSOC患者转移的上皮性肿瘤细胞进行磁分选。（B）HGSOC患者原发性肿瘤（Pri）、腹水和转移性肿瘤（Met）中配对肿瘤细胞与主要ECM蛋白纤维连接蛋白粘附的相对百分比（#1-5）。（C–E）小鼠腹腔（C）中成对肿瘤细胞粘附（#2、4和5-8）的代表性图像和定量，HGSOC患者中肿瘤细胞侵袭（#2，4-6，8和9；D）和间皮清除（#1，3，4，6，8，和9；E）。棒材，200微米（C）、50微米（D）和100微米（E）。（F）暴露于纤维连接蛋白涂层底物FA测量后，配对肿瘤细胞（#1、3、4和6-8）中细胞骨架（指骨蛋白）和FA（帕西林）的免疫荧光；n个= 20. 棒材，20µm。（G）腹膜内植入等量配对肿瘤细胞（#1、3、4、6和7；n个=每组6只小鼠）。（H）腹腔内植入等量配对肿瘤细胞形成的微转移的典型H&E染色图像（#7）。棒材，200µm。数据为平均值±SEM，代表四个（B–F）或两个（G和H）独立实验。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；由配对学生的t吨测试。
图2。
图2。
ITGA5公司高的ATC对OC腹膜转移至关重要。（A）从HGSOC患者（#1–5）的原发肿瘤（P）、腹水（A）和转移瘤（M）分离的15个上皮性肿瘤细胞样本中差异表达基因的层次聚类。（B）不同来源的肿瘤细胞之间差异表达的共同特征基因的文氏图，以及在ATC中特异性升高的基因集中表示的主要生物过程及其相关统计意义。（C）不同来源肿瘤细胞中相关整合素家族成员的表达水平。（D）新分离的配对肿瘤细胞中ITGA5、E-cadherin和Vim的免疫印迹。（E）来自TCGA数据集的NCI-60细胞和OC患者组织中ITGA5和CDH1 mRNA表达之间的皮尔逊相关分析。（F）将ITGA5表达的森林样地描述为总生存率（OS）的单变量预测因子的Meta分析。（G）左：OC肿瘤组织中ITGA5低表达和高表达的典型图像。右图：160例浆液性卵巢癌患者的总生存概率的Kaplan–Meier曲线(n个=95）和高(n个=65）ITGA5蛋白表达（用log-rank检验分析）。棒材，100µm。（H）使用CRISPR/Cas9系统在SKOV3中编辑ITGA5。上图：靶向ITGA5外显子3/4的sgRNAs 1-3示意图。底部：使用干扰sgRNA（模拟）或sgRNA1-3转导的SKOV3细胞的基因组PCR产物通过T7E1分析进行分析。（一）用干扰sgRNA（对照）或sgRNA1-3转导的SKOV3细胞用ITGA5进行免疫印迹。（J）对照组或sgRNA2组SKOV3或OV90细胞的体外粘附分析。（K）等效数量PKH-67标记对照和PKH-26标记sgRNA2转导SKOV3的体内粘附示意图。棒材，100µm。（L和M）由对照SKOV3和ITGA5-缺陷（sgRNA2组）SKOV5细胞绘制的代表性生物发光图像（L）和生长曲线（M）(n个=每组10只小鼠）。数据是平均值±SEM。数据是一个实验（A–C和E–G）和两个（D、H、I、L和M）或三个（J和K）独立实验的代表。**，P<0.01；***，P<0.001，由Student’s确定t吨测试。
图3。
图3。
在OC腹膜播散过程中，以CAF为中心的异型球体充当MU。（A）HGSOC（#2、4和8）和LGSOC患者（#01、02和04）腹水组织的代表性H&E染色。棒材，50µm。（B）对腹水中的单个细胞进行流式细胞术分析，以确定这些上皮细胞、白细胞、内皮细胞和成纤维细胞的百分比。（C）代表性流式细胞仪图（顶部）和频率图（底部）显示了上述主要常驻细胞类别在HGSOC和LGSOC腹水中的表达百分比。（D）HGSOC衍生球体中EpCAM与α-SMA、PDGFRβ或脯氨酰4-羟化酶的双重免疫荧光染色。棒材，100µm。（E）等效GFP转染SKOV3细胞和PKH-26标记CAF腹膜植入示意图（#1、2和5）。（F和G）首次植入肿瘤细胞和CAF 4小时后，腹膜异型球体30分钟（F）的代表性免疫荧光图像及其与腹膜、肠系膜和网膜等有利部位的粘附。棒材，100µm。（H）免疫荧光图像显示植入后1周，粘连球体在腹膜腔内扩散。棒材，200微米（左）和50微米（右）。（一）植入2周后新形成的转移性结节的典型图像。棒材，200µm。（J）首次植入4周后，小鼠腹水中异型球体的典型免疫荧光图像。棒材，100µm。数据为平均值±SEM，代表四个（A、C和D）或三个（F–J）独立实验。*，P<0.05；***，P<0.001，由Student’s确定t吨测试。
图4。
图4。
HGSOC衍生的CAF促进LGSOC-ATC中MU的形成并促进腹膜转移。（A）HGSOC（AC#1-3）和LGSOC（AC#01-03）患者腹水细胞（AC）中CAF标记物（FAP、α-SMA和PDGFRβ）和上皮标记物CK7的免疫印迹。SKOV3作为上皮细胞的阳性对照，而MRC5细胞作为成纤维细胞的阳性对照。（B）在没有或存在HGSOC衍生CAF的情况下，悬浮培养中由LGSOC衍生的ATC形成的异型球体的代表性图像（#2、3和6）。棒材，50µm。（C）在没有或存在CAF（#2、4和7）的情况下，LGSOC-ATC（#02）腹膜粘连的代表性图像来自HGSOC。棒材，100µm。（D）在缺乏或存在HGSOC衍生CAF（#2、7和8；n个=每组8只小鼠）。棒材，200µm。数据为平均值±SEM，代表两个（A、C和D）或三个（B）独立实验。***，P<0.001，由Student’s确定t吨测试。
图5。
图5。
CAF选择性招募ITGA5高的ATCs形成MU并进一步维持ATCs中ITGA5的表达。（A）描绘了在非粘附培养条件下从单个SKOV3细胞中分离SKOV4细胞，形成具有CAF（#1–4）的异型球体，以及进一步进行mRNA分析的步骤。（B）热图详细说明了从异型球体分离出的SKOV3细胞和那些剩余的单个SKOV4细胞之间的差异表达基因。框中显示了球形SKOV3细胞中过度表达的前10个基因。（C）对从微阵列数据中提取的相关整合素表达水平进行比较分析。（D）GFP转染的肿瘤细胞与CAF（#5、8和9）在存在或不存在IgG、整合素α2（Ab-ITGA2）、α5（Ab-ITGA5）或β4（Ab-IGTB4）的中和抗体的情况下形成的异型球体的代表性图像。棒材，100µm。（E）量化D中所述各组形成的球体中包含的平均细胞数。（F）与异形球体中的CAF（#7和#8）共培养前后SKOV3和OV90细胞中E-cadherin、Vim、ITGA5和ITGB1的免疫印迹。（G）免疫印迹法验证与CAF（#7和#8）在异球体内共培养前后原代ATC中ITGA5表达的变化。（H和I）两例HGSOC患者原发性肿瘤和转移瘤中ITGA5和α-SMA双重免疫荧光染色的代表性图像，DAPI复染。棒材，50µm。数据是平均值±SEM。数据是一个实验（B和C）和三个（D和E）或两个（F–I）独立实验的代表。**，P<0.01；***，P<0.001；n.s.，无意义；由学生决定t吨测试。
图6。
图6。
MU中ATC ITGA5的表达需要依赖CAF的EGF分泌。（A）对照CAF（#1）和用SKOV3 CM或TGF-β1（100 ng ml）引物的CAF的细胞因子谱–1)48小时。列出了经CM或TGF-β1治疗的CAF中升高的共享细胞因子。（B）不同细胞因子处理SKOV3细胞48小时后ITGA5的Western blot分析。（C）粘附培养物中SKOV3和CAFs（#8和9）、SKOV3高脂蛋白以及SKOV3和CAFs形成的MUs中EGF的代表性免疫荧光图像。棒材，50µm。（D）用ELISA法评估8例HGSOC患者MU微环境和相应腹水大环境中EGF的分泌。（E）在存在或不存在EGF中和抗体或IgG对照的情况下，与MU中的CAF（#6和#8）共培养后，对对照组和分离的肿瘤细胞中的ITGA5进行免疫印迹。（F）的示意图ITGA5公司发起人报告人构建（top）和分析ITGA5公司如E。（G）在存在或不存在IgG或EGF中和抗体的情况下，SKOV3和CAF（#4、9和10）异型球体形成的代表性图像和量化。棒材，100µm。（H和I）对照IgG和EGF中和抗体组中SKOV3-Luc和CAF（#7和9）共注射产生肿瘤的小鼠的代表性i.p.生物发光图像（H）和存活曲线（i）(n个=每组10只小鼠）。（J）从用对照IgG或EGF中和抗体处理的组中分离的腹膜肿瘤细胞中ITGA5的免疫印迹。（K）使用CRISPR/Cas9系统在SKOV3中编辑EGFR。上图：靶向EGFR基因外显子3/5的sgRNA1-3示意图。底部：用T7E1分析用干扰sgRNA（mock）或sgRNA1-3转导的SKOV3细胞的基因组PCR产物。（左）用干扰sgRNA（对照）或sgRNA1-3转导的SKOV3细胞进行EGFR免疫印迹。（百万）对照组和EGFR-deficient SKOV3-Luc细胞与CAF联合形成的肿瘤生长曲线（#9和#10；n个=每组10只小鼠）。数据为平均值±SEM，代表两个（A、B、E和H–M）或三个（C、D、F和G）独立实验。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001，由Student’s确定t吨测试。
图7。
图7。
针对腹水中的CAF干扰MU并减弱OC传播。（A）OC肿瘤细胞和原发性CAF（#1–3）暴露于不同剂量的伊马替尼（ima；0–100 nM）48小时后的细胞活性分析。（B）在存在或不存在20 nM伊马替尼的情况下，初级CAF（#2、3和5）或与GFP转染的肿瘤细胞悬浮共培养的球体形成的代表性图像和量化。棒材，50µm。（C）GFP细胞凋亡率的流式细胞术分析+SKOV3细胞在含有CAF（#2、#5和#6）的异型球体中培养指定时间，有无20 nM伊马替尼。（D）通过ELISA评估在存在或不存在不同剂量伊马替尼的情况下，与SKOV3细胞共培养的CAF（#3、#5和#8）分泌EGF的情况。（E）ITGA5在对照SKOV3和OV90细胞中的免疫印迹，或在有或无20 nM伊马替尼的情况下与CAF（#5和#8）异型共培养后。（F）将SKOV3细胞与ima-primed CAF（#3、7和8）或未经处理的对照细胞共植入1周后，腹膜球粘连的典型图像。棒材，50µm。（G–I）与伊马替尼诱导的CAF（#7和#8）共植入的SKOV3-Luc荷瘤小鼠或未经治疗的对照组的代表性生物发光图像（G）、肿瘤生长曲线（H）和存活曲线（I）(n个=每组10只小鼠）。（J）仅植入SKOV3-Luc细胞或与ima引发或未治疗的CAFs共植入的小鼠肿瘤的H&E和Masson三色染色。棒材，50微米（左）和100微米（右）。数据为平均值±SEM，代表四个（A–C）、两个（D、E和G–J）或三个（F）独立实验。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；由学生决定t吨测试。
图8。
图8。
以CAF为中心的MU的发展模式及其在OC腹膜播散中的作用。在OC经卵巢转移的早期阶段，肿瘤细胞从原发肿瘤上脱落，并在腹腔内与活化的成纤维细胞相遇。肿瘤细胞和CAF之间的相互作用产生特殊的致密异型球体，我们将其命名为OC的MU，因为它们在腹膜粘连和侵袭中起着关键作用。ITGA5调节ATC与位于MU中心的CAF的交互，在那里它们为OC提供初始矩阵支持，以避免失巢。重要的是，激活的CAF-分泌的EGF在MU结构中富集，并特异性诱导ATC上ITGA5表达增强，从而加强MU的完整性，最终促进OC恶化。
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中的注释

  • 成纤维细胞：危险的旅伴。
    施赖伯H。 施赖伯H。 《实验医学杂志》2019年3月4日；216(3):479-481. doi:10.1084/jem.20181850。Epub 2019年2月1日。 《实验医学杂志》2019年。 采购管理信息：30710056 免费PMC文章。

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