跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2019年3月29日；294（13）：4738-4758。
doi:10.1074/jbc。RA118.005008。 Epub 2019年2月1日。

富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）的G2019S变异体通过损害GTPase RAB8A的功能改变溶酶体内转运

皮拉尔·里弗罗·雷奥斯 1, 玛丽亚·罗莫·洛扎诺 1, 杰苏斯·马德罗·佩雷斯 1, 安德鲁·普·托马斯 2, Alice Biosa公司 三, 伊丽莎·格雷吉奥 三, 萨宾·希尔菲克 4
附属公司

富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）的G2019S变异体通过损害GTPase RAB8A的功能改变溶酶体内转运

皮拉尔·里弗罗·雷奥斯等。 生物化学杂志. .

摘要

编码富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）的基因突变是遗传性帕金森病的常见病因。LRRK2调节各种细胞内小泡运输途径，包括内溶酶体降解事件，如表皮生长因子受体（EGFR）降解。最近的研究表明，参与分泌和内吞再循环的RAB蛋白子集是LRRK2激酶底物体内然而，LRRK2介导的这些底物磷酸化对膜转运的影响尚不清楚。在这里，使用一系列免疫荧光和下拉分析，我们报告活性或缺磷RAB8A变异体的表达可以挽救G2019S LRRK2介导的内溶体膜转运效应。同样，激活RAB8A的RAB11-Rabin8-RAB8B级联上调也会逆转这些贩运赤字。RAB8A的缺失模拟了G2019S LRRK2对内溶酶体贩运和RAB7A活性降低的影响。致病性G2019S LRRK2的表达或RAB8A的丢失通过导致其在RAB4阳性的内吞小室中积聚而干扰EGFR降解，伴随着EGFR再循环的缺陷，并且在活性RAB7A的表达后被挽救。显性负性RAB7A表达导致EGF降解、RAB4室中的积累和EGFR再循环的缺陷相似，这些都是在活性RAB8A表达后修复的。综上所述，这些发现表明，致病性G2019S LRRK2通过损害RAB8A功能，解除了内溶酶转运和内吞再循环事件的调控。

关键词：GTP酶；帕金森病；RAB7A；RAB8A；拉布；早期回收隔间；内溶酶体；富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）；溶酶体；神经变性；蛋白质稳态；受体内吞作用；受体再循环。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，他们与本文的内容没有利益冲突

数字

图1。
图1。
致病性G2019S-LRRK2，但不是激酶失活的G2019S-K1906M变体，导致EGF结合和降解缺陷。 A类如图所示，HeLa细胞被pCMV转染或与GFP和myc标记的G2019S LRRK2、FLAG标记的G22019S或G2019S-K1906M LRRK1共同转染；在4°C下与Alexa555-EGF孵育30分钟；清洗以去除未结合的荧光EGF；并按照“材料和方法”所述进行固定和加工比例尺，10微米。B类，表面结合荧光EGF的定量(t吨=0 min）转染不同结构的细胞，并归一化为pCMV转染细胞的EGF表面结合(控制).n个=3个独立实验。*，第页< 0.05.C类，转染有指示结构的HeLa细胞可以在4°C下结合Alexa555-EGF，清洗以去除未结合的荧光EGF，然后在37°C下移动10分钟以允许荧光EGF内化和降解。比例尺，10微米。D类，10天后进行Alexa555-EGF定量(左边)和30分钟(正确的)内化并标准化为每种条件下Alexa555-EGF结合量t吨=0 min，从而反映了内化结合荧光EGF的百分比。n个=3个独立实验。*，第页< 0.05; ***,第页< 0.005.E类，每250μm荧光EGF-阳性斑点总数的量化2根据10后所示的不同结构的表达(左边)和30分钟(正确的)内部化。n个=3个独立实验。*，第页< 0.05; ***,第页< 0.005.F类，因为免疫荧光信号强度与单个结构的大小直接相关，所以每个点的信号强度被量化为10(左边)和30分钟(正确的)内化后，不同条件之间没有变化，进一步表明EGF降解不足，而不是每个细胞内化的荧光EGF数量增加。G公司，HEK293T细胞转染所示结构，然后分析内源性EGFR表达水平。H（H），HEK293T细胞转染致病性G2019S LRRK2或激酶激活型G2019S-K1906M变异体，并在放线菌酮存在下饥饿血清1小时以阻止新的蛋白质合成，在指定的时间点用非标记EGF刺激EGFR内化。通过Western blotting分析细胞提取物的EGFR水平，并使用微管蛋白作为负荷对照。我，量化转染G2019S LRRK2或G2019S-K1906M的HEK293T细胞在不同时间点的EGFR降解，并将数值归一化为微管蛋白作为负荷控制。n个=4个独立实验。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ****,第页< 0.001. 全部误差线代表S.E.M。
图2。
图2。
活性RAB8A和Rabin8拯救LRRK2介导的EGF结合和降解缺陷。 A类，用任一空pCMV载体转染HeLa细胞(控制)或指示的RAB8A结构，然后量化表面结合荧光EGF的量。n个=4个独立实验。*，第页< 0.05.B类，按照指示转染细胞，10天后定量转染细胞内的Alexa555-EGF(左边)和30分钟(正确的)内部化。值标准化为Alexa555-EGF绑定量t吨= 0.n个=4个独立实验。*，第页< 0.05.C类，用G2019S LRRK2和指示的RAB8A构建物共同转染细胞，并对表面结合荧光EGF进行定量。n个=8个独立实验。*，第页< 0.05.D类，用G2019S LRRK2和指示的RAB8A构建物共同转染细胞，10天后定量内化Alexa555-EGF(左边)和30分钟(正确的)内部化。n个=8个独立实验。****，第页< 0.001.E类，用空pCMV载体转染细胞(控制)或使用Rabin8，并对表面结合荧光EGF进行定量。n个=3个独立实验。F类，按照指示转染细胞，然后在10(左边)和30分钟(正确的).n个=3个独立实验。G公司，用空pCMV载体转染细胞(控制)或与G2019S致病性LRRK2和pCMV载体或Rabin8共转染，并对表面结合荧光EGF进行定量。n个=3个实验。*，第页< 0.05.H（H），按照指示转染细胞，然后按照上述方法定量内化荧光EGF。n个=3个独立实验。***，第页< 0.005. 全部误差线代表S.E.M。
图3。
图3。
RAB11挽救了LRRK2介导的EGFR贩运延迟。 A类，HeLa细胞与G2019S LRRK2和指示的RAB11构建物共转染，并对表面结合荧光EGF进行定量。n个=3个独立实验。*，第页< 0.05.B类，用空pCMV载体转染细胞(控制)或与G2019S LRRK2和指示的RAB11构建物共转染，然后在10(左边)和30分钟(正确的).n个=3个独立实验。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.005.C类，用空pCMV载体转染细胞(控制)或所指示的RAB11构建体，并定量表面结合的荧光EGF的量。n个=3个独立实验。D类，按照指示转染细胞，然后在10(左边)和30分钟(正确的).n个=3个独立实验。E类，用空pCMV载体转染细胞(控制)或与G2019S LRRK2和指示的RAB18构建物共转染，并对表面结合荧光EGF进行定量。n个=3个独立实验。*，第页< 0.05.F类，按照指示转染细胞，然后在10(左边)和30分钟(正确的).n个=3个独立实验。***，第页< 0.005.G公司，与中相同E类，但细胞转染了任何一种空的pCMV载体(控制)或所指示的RAB18构建体。n个=3个独立实验。H（H），与中相同F类，但细胞转染了任何一种空的pCMV载体(控制)或指示的RAB18构造。n个=3个独立实验。全部误差线代表S.E.M。
图4。
图4。
磷酸化RAB8A，而非WT或磷酸化RAB8A变体，逆转LRRK2介导的EGFR贩运效应。 A类，HeLa细胞转染任何一个空的pCMV载体(控制)或指示的RAB8A结构，并对表面结合荧光EGF进行量化。n个=4个独立实验。*，第页< 0.05.B类，细胞转染指示的构建物，然后量化内部荧光EGF。n个=4个独立实验。*，第页< 0.05.C类，用G2019S LRRK2和指示的RAB8A构建物共同转染细胞，并对表面结合荧光EGF进行定量。n个=8个独立实验。*，第页< 0.05.D类，用指定的结构转染细胞，并在10(左边)和30分钟(正确的).n个=8个独立实验。*，第页< 0.05; ***,第页< 0.005; ****,第页< 0.001. 全部误差线代表S.E.M。
图5。
图5。
敲除RAB8A模拟G2019S LRRK2介导的内溶酶体运输缺陷。 A类HeLa细胞未转染（−）或转染ctrl-siRNA或RAB8A-siRNA，细胞提取物（30μg）通过Western blotting分析RAB8A蛋白水平和微管蛋白作为负荷对照。B类，量化中描述的实验类型A类RAB8A-siRNA存在时的RAB8A水平归一化为ctrl-siRNA存在的水平。n个=3个独立实验。*，第页< 0.05.C类，细胞未经处理（−）或用ctrl siRNA或RAB8A siRNA转染，并定量表面结合的荧光EGF。n个=3个独立实验。*，第页< 0.05.D类细胞未经处理（−）或转染ctrl-siRNA或RAB8A-siRNA，然后在10(左边)和30分钟(正确的).n个=3个独立实验。**，第页<0.01；***，第页< 0.001.E类在没有或存在GFP标记的活性RAB7A（RAB7A-Q67L）的情况下，细胞未经处理或与ctrl-siRNA或RAB8A-siRNA共转染，并对表面结合荧光EGF进行定量。n个=3个独立实验。*，第页< 0.05.F类，细胞未经处理或与ctrl-siRNA或RAB8A-siRNA共转染，在没有或存在RAB7A-Q67L的情况下，内化荧光EGF定量为10(左边)和30分钟(正确的).n个=3个独立实验。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01.G公司如图所示，用ctrl-siRNA或RAB8A-siRNA处理细胞，并使用与GST偶联的RILP的RAB7-结合域从细胞裂解物（300μg）中去除RAB7的GTP-结合形式。输入（10%）与下拉框一起运行，以证明ctrl-siRNA或RAB8A-siRNA处理的细胞中总RAB7蛋白的水平相等，并在单独的凝胶上分析RAB8A和微管蛋白的水平。H（H），中所述类型的实验G公司定量，并表达GST-RILP分离的RAB7的量相对于输入量。n个=3个独立实验。***，第页< 0.005.我如图所示，用ctrl-siRNA或RAB8A-siRNA处理细胞，并使用构象特异性抗体从细胞裂解物（2 mg）中免疫沉淀活性RAB7。作为阳性对照，ctrl-siRNA处理的细胞提取物与100μ米GTPγS在免疫沉淀前激活RAB7A。输入（1%）与下拉框一起运行，以证明ctrl-siRNA或RAB8A-siRNA处理细胞中的总RAB7蛋白水平相等，并在单独的凝胶上分析RAB8A和微管蛋白的水平。全部误差线代表S.E.M。
图6。
图6。
致病性LRRK2或RAB8A的敲除导致EGF在RAB4阳性的内吞室中积聚。 A类用空pCMV载体或致病性LRRK2转染HeLa细胞，或与GFP标记的RAB4共转染，并对表面结合荧光EGF进行定量。n个=3个独立实验。*，第页< 0.05.B类，按照指示转染细胞，然后在10(左边)和30分钟(正确的).n个=3个独立实验。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01.C类例如，与GFP-RAB4和空pCMV载体或致病性LRRK2共同转染的HeLa细胞。荧光EGF内化后20分钟拍摄现场照片箭头指向GFP-RAB4–含有Alexa647-EGF的阳性囊泡。比例尺，10微米。D类，Alexa647-EGF与GFP-RAB4共定位的量化（Manders系数1×100），每次实验从15–20个细胞。n个=6个独立实验。***，第页< 0.005.E类例如，HeLa细胞与GFP-RAB4和ctrl-siRNA或RAB8A-siRNA共转染。如上所述拍摄现场照片。箭头指向GFP-RAB4–含有Alexa647-EGF的阳性囊泡。比例尺，10微米。F类，Alexa647-EGF与GFP-RAB4共定位的量化（Manders系数1×100），每次实验从15–20个细胞。n个=3个独立实验。**，第页< 0.01. 全部误差条代表S.E.M。
图7。
图7。
致病性G2019S LRRK2导致EGFR循环不足。 A类例如，HeLa细胞转染pCMV或与mRFP和G2019S或激酶活性G2019S-K1906M LRRK2共同转染，并在没有渗透性的情况下用抗EGFR胞外区的抗体染色，以仅显示表面EGFR。比例尺，10微米。B类，EGFR表面水平荧光强度的量化t吨=0分钟(稳态)在触发EGFR内部化时(脉冲)或寻求不同的时间点来评估回收率(追逐)如“材料和方法”所述n个=3个独立实验。*，第页< 0.05; ***,第页< 0.005.C类，如图所示转染HeLa细胞，通过Western blotting分析细胞提取物（30μg）的FLAG-标记LRRK2水平和微管蛋白作为负荷对照。美国。，任意单位。全部误差线代表S.E.M。
图8。
图8。
激活的RAB7A表达可以缓解RAB4阳性内吞室中EGF的积累以及RAB8A敲低导致的EGFR再循环缺陷。 A类如图所示，HeLa细胞与GFP-RAB4和ctrl-siRNA或RAB8A-siRNA共转染，有或无RAB7A-Q67L表达。荧光EGF内化后20分钟拍摄现场照片箭头指向GFP-RAB4–含有Alexa647-EGF的阳性囊泡。获得了一张独立的图片（543 HeNe激光线），以确认所有病例中不同mRFP标记的RAB7A结构的共表达。比例尺，10微米。B类，在存在或不存在不同RAB7A构建物的情况下，对Alexa647-EGF与GFP-RAB4和ctrl-siRNA或RAB8A-siRNA的共定位进行量化，如所示（Manders系数1×100），每个实验从15–20个细胞进行。n个=3个独立实验。**，第页< 0.01; ***,第页< 0.005.C类用所示的ctrl-siRNA或RAB8A-siRNA处理HeLa细胞，并转染所示的RAB7A构建物，通过Western blotting分析细胞提取物（30μg）的RAB8A蛋白水平、mRFP-RAB7A蛋白水平（抗RAB7抗体）和GAPDH作为负荷对照。D类用ctrl-siRNA或RAB8A-siRNA处理HeLa细胞，如指示的那样，与指示的RAB7A构建物共转染或不共转染。按照“材料和方法”中的描述进行EGFR回收分析，发现EGFR表面水平和RAB8A-siRNA上的EGFR回收存在缺陷，活性RAB7A表达后可恢复。n个=3个独立实验。*，第页< 0.05; ***,第页< 0.005; ****,第页< 0.001.美国。，任意单位。全部误差线代表S.E.M。
图9。
图9。
活性RAB7A表达挽救了由于G2019S LRRK2表达引起的EGF在RAB4阳性内吞区室中的积聚和EGFR再循环的缺陷。 A类如图所示，与GFP-RAB4和空pCMV载体或致病性LRRK2共同转染的HeLa细胞的例子，有或没有RAB7A-Q67L表达。荧光EGF内化后20分钟拍摄现场照片箭头指向GFP-RAB4–含有Alexa647-EGF的阳性囊泡。获得了一张独立的图片（543 HeNe激光线），以确认所有病例中不同mRFP标记的RAB7A结构的共表达。比例尺，10微米。B类，在存在或不存在mRFP标记的RAB7A构建体（Manders系数1×100）的情况下，在共表达空pCMV载体或G2019S LRRK2的细胞中，定量Alexa647 EGF与GFP-RAB4在每个实验15-20个细胞中的共定位。n个=3个独立实验。**，第页< 0.01.C类用所示的构建物转染HeLa细胞，通过Western blotting分析细胞提取物（30μg）的FLAG标记G2019S-LRRK2、mRFP-RAB7A蛋白水平（抗RAB7抗体）和GAPDH作为负荷对照。D类如图所示，在存在或不存在mRFP标记的RAB7A构建物的情况下，用空pCMV载体或致病性G2019S LRRK2转染HeLa细胞，并在指定的时间点测定EGFR表面水平和EGFR再循环。n个=3个独立实验。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.005; ****,第页< 0.001.美国。，任意单位。全部误差线代表S.E.M。
图10。
图10。
显性负性RAB7A的表达导致EGFR转运缺陷、EGF在RAB4阳性内吞室中的积聚以及EGFR再循环缺陷，这些缺陷在活性RAB8A表达后被逆转。 A类，HeLa细胞转染任何一个空的pCMV载体(控制)或在活性RAB8A（RAB8A-Q67L）存在或不存在的情况下，具有显性负RAB7A（RAB7A-T22N），并量化表面结合荧光EGF。n个=3个独立实验。*，第页< 0.05.B类，细胞转染所示结构，然后在10(左边)和30分钟(正确的).n个=3个独立实验。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01.C类如图所示，与GFP-RAB4和mRFP-RAB7A-T22N或mRFP-RAB7A-S22N和FLAG-标记RAB8A-Q67L共同转染的HeLa细胞的示例。荧光EGF内化后20分钟拍摄现场照片箭头指向GFP-RAB4–含有Alexa647-EGF的阳性囊泡。获得了一张独立的图片（543 HeNe激光线），以确认所有病例中mRFP标记的RAB7A结构体的共表达。比例尺，10微米。D类，在有或无不同RAB7A结构的情况下，定量Alexa647-EGF与GFP-RAB4的共定位，如所示（Manders系数1×100），每次实验从15–20个细胞获得。n个=3个独立实验。**，第页< 0.01.E类，在有无RAB7A-T22N和RAB8A-Q67L构建物的情况下，对Alexa647-EGF与GFP-RAB4的共定位进行量化，如所示（Manders系数1×100），每次实验从15–20个细胞进行。n个=3个独立实验。*，第页< 0.05.F类用所示的构建物转染HeLa细胞，通过Western blotting分析细胞提取物（30μg）的mRFP标记RAB7A-T22N、FLAG标记RAB8A-Q67L和GAPDH作为负荷对照。G公司，在不存在或存在RAB7A-Q67L的情况下，用空pCMV载体或显性阴性RAB7A-T22N转染HeLa细胞，并在所指示的时间点测定EGFR表面水平和EGFR再循环。n个=3个独立实验。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.005.美国。，任意单位。全部误差线代表S.E.M。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Paisán-Ruíz C.、Jain S.、Evans E.W.、Gilks W.P.、Simón J.、van der Brug M.、López de Munain A.、Aparicio S.、Gil A.M.、Khan n.、Johnson J.、Martinez J.R.、Nicholl D.、Carrera I.M.、Pena A.S.等人（2004）克隆导致PARK8-连锁帕金森病的基因突变。神经元44、595–600 10.1016/j.Neuron.2004.10.023-内政部-公共医学
    1. Zimprich A.、Biskup S.、Leitner P.、Lichtner P.、Farrer M.、Lincoln S.、Kachergus J.、Hulihan M.、Uitti R.J.、Calne D.B.、Stoessl A.J.、Pfeiffer R.F.、Patenge N.、Carbajal I.C.、Vieregge P.等（2004）LRRK2突变导致常染色体显性帕金森综合征伴多形性病理。神经元44、601–607 10.1016/j.Neuron.2004.11.005-内政部-公共医学
    1. Healy D.G.、Falchi M.、O'Sullivan S.S.、Bonifati V.、Durr A.、Bressman S.、Brice A.、Aasly J.、Zabetian C.P.、Goldwurm S.、Ferreira J.、Tolosa E.、Kay D.M.、Klein C.、Williams D.R.等人（2008），LRRK2-相关帕金森病的表型、基因型和全球遗传外显率：一项病例对照研究。柳叶刀神经病学7，583–590 10.1016/S1474-4422（08）70117-0-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Cookson M.R.和Bandmann O.（2010年），《帕金森氏病：来自通路的见解》。嗯，分子遗传学。19，R21–R27 10.1093/hmg/ddq167-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Greggio E.、Jain S.、Kingsbury A.、Bandopadhyay R.、Lewis P.、Kaganovich A.、van der Brug M.P.、Beilina A.、Blackinton J.、Thomas K.J.、Ahmad R.、Miller D.W.、Kesavapany S.、Singleton A.、Lees A.等人（2006年）。突变LRRK2/dadadadarin.Neurobiol的毒性作用需要激酶活性。数字化信息系统。23329–341 10.1016/j.nbd.2006.04.001-内政部-公共医学

出版物类型

MeSH术语