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.2019年1月30日;14(1):e0209665。
doi:10.1371/journal.pone.0209665。 2019年eCollection。

III型中间丝波形蛋白调节细胞器分布并调节自噬

附属公司

III型中间丝波形蛋白调节细胞器分布并调节自噬

奥尔加·比斯库等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

细胞骨架蛋白波形蛋白在细胞溶质内细胞器定位中起着关键作用,并与包括自噬在内的许多细胞过程的调节有关,然而,波形蛋白如何调节自噬仍相对未知。在这里,我们报告了使用甾体内酯威瑟芬A(WFA)抑制波形蛋白导致波形蛋白聚集,这与细胞器(包括自噬体和溶酶体)从胞浆重新定位到近核位置有关。波形蛋白抑制导致自噬体积累,我们证明这是由于雷帕霉素(mTORC1)活性的机制靶点的调节和自噬小体与溶酶体融合的破坏所致。我们认为波形蛋白在自噬体和溶酶体定位中发挥生理作用,从而确定波形蛋白是调节mTORC1和自噬的关键因素。

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数字

图1
图1。WFA导致波形蛋白聚集到一个相邻的位置。
A) HEK293细胞内内源性波形蛋白、微管蛋白和肌动蛋白(白色)的免疫荧光分析,用1–5μM的WFA处理4h,并与DMSO载体对照进行比较。细胞核用DAPI(蓝色)染色。显示了具有代表性的图像。比例尺等于10μm。B) 免疫印迹分析HEK293细胞内内源性波形蛋白、微管蛋白和肌动蛋白水平,用1.5μM WFA处理6小时,DMSO载体对照,并与未处理细胞(Unt)进行比较。由于波形蛋白(55 kDa)、微管蛋白(50 kDa,actin)和肌动蛋白(42 kDa。波形蛋白、微管蛋白和肌动蛋白的密度测定值如图S2所示。C) HEK293细胞的代谢活性用100 nM-2μm的WFA浓度进行评估,持续24小时,并与未经处理的细胞进行比较。Triton-X被用作毒性的阳性对照。D) i)HEK293细胞未经处理或用DMSO载体对照或1.5μm WFA处理6h,用Annexin V/PI染色并用流式细胞仪分析。双向方差分析**p<0.01(n=2个独立实验)。ii)在流式细胞术之前,通过显微镜分析细胞形态。Brightfield图像以20倍放大率拍摄。显示了具有代表性的图像。
图2
图2。波形蛋白抑制导致LC3的积累。
A) i)HEK293 GFP-LC3细胞内内源性LC3的免疫印迹分析,用1.5μM WFA、DMSO载体对照处理6小时,并与未处理细胞(Unt)进行比较。细胞裂解物溶解并转移到膜上后,水平切割膜并与LC3和肌动蛋白特异性抗体孵育。ii)通过密度测定法量化LC3-ii和LC3-I之间的比率。B) i)HEK293 GFP-LC3细胞活细胞成像的代表性图像,用1.5μm WFA、DMSO载体对照物处理4小时,并与未处理细胞进行比较。ii)用1.5μM的WFA、DMSO载体对照物处理后0、2、4和6 h,细胞出现>5个自噬体的数量,并与未处理细胞进行比较。双向方差分析**p<0.01,***p<0.001(n=3个独立实验,每个实验分析20个细胞)C)流式细胞术分析HEK293 GFP-LC3细胞,用160nM BAF、EBSS和160nM BA或1.5μM WFA和160nM-BAF处理2 h(i)、4 h(ii)和6 h(iii)。对细胞进行GFP-LC3荧光强度分析。显示了几何平均值(iv)的代表性色谱图和量化。统计分析将WFA和BAF处理的细胞与仅BAF处理(蓝星)的细胞进行比较,并将EBSS和BAF治疗的细胞与只BAF的处理(紫星)进行比较。双向方差分析ns=p>0.05,**p≤0.01,***p≤0.0001(n=3个独立实验)。
图3
图3。波形蛋白抑制导致自噬体的近圆形聚集。
A) HEK293-GFP-LC3细胞中内源性波形蛋白(白色)、微管蛋白(红色)和GFP-LC_3的免疫荧光分析,这些细胞仅用160nM的BAF、1.5μM的WFA或1.5μM WFA和160nM BAF处理6小时,并与未处理的细胞进行比较。细胞核用DAPI(蓝色)染色。合并的面板显示GFP-LC3相对于波形蛋白、微管蛋白和细胞核的位置。比例尺等于10μm。显示了具有代表性的图像。B) 黄线定义了波形蛋白(面板i-iv)或自噬体(面板v-viii)覆盖的区域。比例尺等于10μm。显示了具有代表性的图像。C) 从免疫荧光图像定量的每个细胞的自噬体数量(n=6个细胞)。学生的t检验*p=0.0144,***p=0.0008。D) 根据免疫荧光图像定量的波形蛋白区域(n=6个细胞)。单向方差分析*p≤0.05。E) 免疫荧光图像定量的自噬体面积(n=6个细胞)。学生的t检验*p=0.011。
图4
图4。微管抑制对波形蛋白和自噬体分布的影响。
A) 用160nM BAF、500nM NOC或500nM NO C和160nM BA F处理HEK293-GFP-LC3细胞6小时,并与未处理细胞进行比较,对内源性波形蛋白(白色)、微管蛋白(红色)和GFP-LC3.进行免疫荧光分析。细胞核用DAPI(蓝色)染色。合并的面板显示GFP-LC3相对于波形蛋白、微管蛋白和细胞核的位置。比例尺等于10μm。显示了具有代表性的图像。B) 从免疫荧光图像定量的每个细胞的自噬体数量(n=6个细胞)。C) 免疫荧光图像定量的波形蛋白区域(n=6个细胞)。D) 免疫荧光图像定量的自噬体面积(n=6个细胞)。
图5
图5。波形蛋白抑制导致溶酶体的近圆形聚集。
A) HEK293细胞内内源性波形蛋白(绿色)和内源性LAMP-1(红色)的免疫荧光分析,用1.5μM WFA或500 nM NOC处理6小时,并与未处理细胞进行比较。细胞核用DAPI(蓝色)染色。在合并的面板中,vimentin和LAMP1共存的区域显示为黄色。比例尺等于10μm。显示了具有代表性的图像。B) 根据免疫荧光图像量化的每个细胞的溶酶体数量(n=6个细胞)。C) 免疫荧光图像定量的波形蛋白区域(n=6个细胞)。单向方差分析**p=0.0032。D) 免疫荧光图像定量的溶酶体面积(n=6个细胞)。单向方差分析**p=0.0044。E) 用1.5μM WFA处理HEK293-GFP-LC3细胞长达6小时,并与未经处理的细胞进行比较,对GFP-LC2和溶酶体(用Lysotracker红染色)进行活细胞成像分析。在合并的面板中,GFP-LC3和溶酶体共定位的区域显示为黄色。显示了6小时治疗的典型图像。比例尺等于10μm。F) 活细胞成像定量的每个细胞的自噬体数量(n=6个细胞)。学生的t检验**p=0.0046。G) 活细胞成像定量的每个细胞溶酶体数量(n=6个细胞)。学生的t检验**p=0.0036。H) 通过活细胞成像定量的自噬体和溶酶体共享的面积(n=6个细胞)。学生的t检验**p=0.0059。一) HEK293-GFP-LC3细胞经1.5μM WFA处理6小时后的细胞外pH值测量,并与未经处理的对照组进行比较。
图6
图6。波形蛋白抑制调节mTORC1活性以及自噬体和溶酶体的融合。
A) i)HEK293细胞未经处理或用DMSO、1μM WFA或2μM WFA处理6小时。对蛋白质裂解物进行内源性rpS6、磷酸化rpS6(p-rpS6(S235/236))和微管蛋白的免疫印迹。ii)通过密度测定法量化rpS6/p-rpS6(归一化为微管蛋白)的比率。B) i)瞬时转染GFP-RFP-LC3质粒并用EBSS、160nM BAF或1.5μM WFA处理6 h的HEK293细胞的免疫荧光分析。通过共焦显微镜评估绿色和红色荧光的变化。对每种情况下每个细胞的酸化自噬体(RFP+GFP-)和中性自噬体量(RFP+GFP+)进行计数。(n=3个单元格)。比例尺等于10μm。ii)酸化自噬体(RFP+GFP-)与中性自噬体量测(RFP+GFP+)。

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