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.2019年1月28日；9(1):789.
doi:10.1038/s41598-018-37283-2。

GLUT1和GLUT3参与花青素胃转运-基于纳米的靶向方法

奥尔德·奥利维拉 1, 卡塔琳娜·罗马·罗德里格斯 2, 安娜·桑托斯 2, 布鲁诺素食 2, Natércia Brás 3, 安娜·法里亚 1 4 5 6, 康西奥·卡尔豪斯 4 5 6, 维克托·德·弗雷塔斯 1, 佩德罗·巴普蒂斯塔 7, 努诺·马特乌斯 1, 亚历山德拉·R·费尔南德斯 2, 伊瓦·费尔南德斯 8
附属公司

GLUT1和GLUT3参与花青素胃转运-基于纳米的靶向方法

奥尔德·奥利维拉等。 科学代表. .

摘要

花青素可以预防多种人类疾病。然而，很少有研究对其生物利用度进行评估，因此其吸收机制尚不清楚。本研究旨在通过金纳米粒子沉默两种葡萄糖转运蛋白（GLUT1和GLUT3）在人胃上皮细胞（MKN-28）花青素吸收中的作用。从紫肉红薯和葡萄皮中提纯花青素。通过添加GLUT1下的AuNP和/或GLUT3下的AuNPMKN-28细胞。mRNA表达下调与蛋白质表达降低同时发生。在任何一种情况下，丙氨酸-3-O-葡萄糖苷（Mv3glc）的转运都会减少GLUT1下的AuNP和GLUT3下的AuNP当两个运输工具同时被阻挡时。测定了芍药苷-3-（6'-羟基苯甲酰基）-槐糖苷-5-葡萄糖苷（Pn3HBsoph5glc）和芍药苷-3-（6'-羟基苯乙酰基-6〃-咖啡酰基）-Shophoside-5-葡萄苷（Pn 3HBCsoph5Glc），以验证葡萄糖B处糖基酯化对转运蛋白结合的影响。与Mv3glc相比，这两种色素的转运效率较低，可能是由于更复杂结构的空间位阻。有趣的是，对于Pn3HBCsoph5glc，尽管唯一的游离葡萄糖是在C5，并且也观察到了纳米粒子的抑制作用，这加强了葡萄糖在转运中的重要性，无论其位置或取代模式如何。结果支持GLUT1和GLUT3参与花青素的胃吸收。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
在跨上皮运输研究中分析了四种花色苷的化学结构。
图2
图2
Pn3glc、Mv3glc、Pn3HBsoph5glc和Pn3HBCsoph5glc通过MKN-28屏障的转运效率（顶端→ 基底侧）(A类) 4 °C和(B) 37 摄氏度。实验在pH值5.0和pH值7.4的条件下进行。结果表示为运输效率（%）（平均值 ± SEM）。运输效率百分比的计算依据是（基底外侧超时的化合物浓度）/（零小时时顶端的化合物含量）*100。
图3
图3
(A类)GLUT1公司在与20 nM或30 用30%聚乙二醇和抗-GLUT1公司(AuNP@聚乙二醇@反-GLUT1公司)用于9 h、 12个 h和24 37小时 °C，5%（v/v）CO2和99%（v/v）相对湿度。(B)GLUT3公司与20孵育的MKN-28细胞的相对表达 nM或30 用30%聚乙二醇和抗-GLUT3公司(AuNP@聚乙二醇@反-GLUT3公司)用于9 h、 12个 h和24 37小时 °C，5%（v/v）CO2和99%（v/v）相对湿度。通过2计算基因表达变异-∆∆Ct，用作参考GAPDH公司基因。误差条代表至少三个独立实验的SEM*p值 < 相对于9时的相对表达0.05 h培养相应样品。
图4
图4
(A类)GLUT1和β-肌动蛋白的Western Blot分析。(B)GLUT3和β-肌动蛋白的Western Blot分析。代表的西方印记相当于10 在24孔板上生长的MKN-28细胞总蛋白µg并孵育24小时 h，新鲜RPMI培养基补充5.5 mM果糖和0.75 纳米AuNP@PEG1, 0.63 纳米AuNP@PEG3, 1.38 纳米AuNP@PEG1 + 3, 30 纳米GLUT1下的AuNP, 20 纳米GLUT3下的AuNP，或混合GLUT1下的AuNP + 3.在此之后24 h期，细胞再培养24小时 h，根据第一次培养补充新鲜培养基。(C类)GLUT1相对强度值归一化为β-肌动蛋白的相应强度和相应的AuNP@聚乙二醇对照样品。(D类)GLUT3相对强度值归一化为β-肌动蛋白的相应强度和相应的AuNP@聚乙二醇对照样品。误差条表示至少三个独立实验的SEM。斑点边缘上的灰色线表示图像被裁剪的位置。完整的斑点图像可以在补充图S2中找到*p值 < 0.5，**p值 < 0.005，***p值 < 0.0005。
图5
图5
GLUT1公司(A类)和GLUT3公司(B)培养24小时后MKN-28细胞的相对表达 h（黑色条）或24 小时 + 24 h（灰色条），新鲜RPMI培养基补充5.5 mM果糖和30 纳米GLUT1下的AuNP, 20 纳米GLUT3下的AuNP，或混合GLUT1下的AuNP + 3.24天后 收集h细胞或培养额外24个 h，根据第一次培养补充新鲜培养基。基因表达通过2计算-ΔΔCt，用作内部引用GAPDH公司基因，并归一化为包含MKN-28细胞的相应对照样品，该细胞经添加5.5的RPMI培养基处理 mM果糖和0.75 纳米AuNP@聚乙二醇（控制GLUT1下的AuNP), 0.63 纳米AuNP@聚乙二醇（控制GLUT3下的AuNP)，或1.38 纳米AuNP@聚乙二醇（控制GLUT1下的AuNP + 3） ，并在同一时间点收集。误差条代表至少三个独立实验的SEM*p值 < 0.5，**p值 < 0.005，***p值 < 0.0005。
图6
图6
(A类)GLUT1和β-肌动蛋白的Western Blot分析。(B)GLUT3和β-肌动蛋白的Western Blot分析。代表的蛋白质印迹对应于10μg在transwell板上生长并孵育24小时的MKN-28细胞的总蛋白 h，新鲜RPMI培养基补充5.5 mM果糖和0.75 纳米AuNP@PEG1, 0.63 纳米AuNP@PEG3, 1.38 纳米AuNP@PEG1 + 3, 30 纳米GLUT1下的AuNP, 20 纳米GLUT3下的AuNP，或混合GLUT1下的AuNP + 3.在这段时间后，再培养细胞24小时 h，如前所述添加新鲜培养基。(C类)GLUT1相对强度值归一化为β-肌动蛋白的相应强度和相应的AuNP@聚乙二醇对照样品。(D类)GLUT3相对强度值标准化为β-肌动蛋白蛋白的相应强度和相应的AuNP@聚乙二醇对照样品。误差条代表至少三个独立实验的SEM。斑点边缘上的灰色线表示图像被裁剪的位置。完整的斑点图像可以在补充图S3中找到*p值 < 0.5，**p值 < 0.005，***p值 < 0.0005。
图7
图7
Mv3glc通过MKN-28屏障的传输效率（Apical→ 基底侧）。在存在以下物质的情况下，在顶端pH 5.0和基底外侧pH 7.4下进行实验(A类) 30 纳米GLUT1下的AuNP, 20 纳米GLUT3下的AuNP，或0.75 纳米AuNP@聚乙二醇（控制GLUT1下的AuNP)或0.63 纳米AuNP@聚乙二醇（控制GLUT3下的AuNP)(B) 1.38 纳米AuNP@聚乙二醇（控制GLUT1下的AuNP + 3） ，混合了GLUT1下的AuNP + 3，Cythochalasin B（CytB，50 µM）或以下物质的混合物GLUT1下的AuNP + 3和Cythochalasin B（50 微米）。与各自的控制显著不同*p < 0.05.
图8
图8
运输效率(A类)Pn3HBsoph5glc和(B)Pn3HBCsoph5glc通过MKN-28屏障（Apical→ 基底侧）。在30℃的条件下，在pH值5.0和pH值7.4的条件下进行实验 纳米GLUT1下的AuNP, 20 纳米GLUT3下的AuNP，或0.75 纳米AuNP@聚乙二醇（控制GLUT1下的AuNP)或0.63 纳米AuNP@聚乙二醇（控制GLUT3下的AuNP), 1.38 纳米AuNP@聚乙二醇（控制GLUT1下的AuNP + 3） ，混合了GLUT1下的AuNP + 3，胱抑素B（CytB，50 µM）或GLUT1下的AuNP + 3和Cythochalasin B（50 微米）。与各自的游离寡核苷酸纳米颗粒处理有显著不同*p < 0.05.
图9
图9
Mv3glc通过MKN-28屏障的传输效率（Apical→ 基底侧）存在50 不同抑制剂的µM。实验在pH值5.0和pH值7.4的条件下进行。与控制显著不同(AuNP@聚乙二醇)相同孵育时间*p < 0.05.
图10
图10
每个优化结构的表示(A类)GLUT1：多酚复合物和(B)GLUT3：多酚复合物。图中还显示了参与多酚结合的主要氨基酸（用棒状物表示，并按原子类型着色）。GLUT用卡通表示，用灰色表示，而多酚化合物用球棒表示，用原子类型表示。每种多酚的芳香、非芳香糖和非芳香非糖环分别用红色、绿色和橙色表示。GLUTs对所有多酚的结合区域表示为紫色表面。
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