Long non-coding RNA linc00665 promotes lung adenocarcinoma progression and functions as ceRNA to regulate AKR1B10-ERK signaling by sponging miR-98

doi:10.1038/s41419-019-1361-3

.2019年1月28日；10(2):84.

doi:10.1038/s41419-019-1361-3。

长非编码RNA linc00665促进肺腺癌进展，并作为ceRNA通过海绵miR-98调节AKR1B10-ERK信号

庄庄聪¹, 逸飞雕², 杨旭^1 3, 李晓坤², 江志胜⁴, 陈业绍³, 赛光记⁴, 易神^5 6 7 8, 魏德⁹, 永强¹⁰

附属公司

¹南京大学医学院金陵医院心胸外科，210000，南京，中国。
²东南大学金陵医院心胸外科，南京，210000。
³南京医科大学金陵医院心胸外科，南京，210000，中国。
⁴蚌埠医学院金陵医院心胸外科，233030，安徽。
⁵南京大学医学院金陵医院心胸外科，210000，南京，中国。dryishen@nju.edu.cn。
⁶东南大学金陵医院心胸外科，南京，210000。dryishen@nju.edu.cn。
⁷南京医科大学金陵医院心胸外科，南京，210000，中国。dryishen@nju.edu.cn。
⁸蚌埠医学院金陵医院心胸外科，233030，安徽。dryishen@nju.edu.cn。
⁹南京医科大学生物化学与分子生物学系，210000，中国南京。
¹⁰南京大学医学院金陵医院心胸外科，210000，南京，中国。3947885@qq.com。

PMID： 30692511
预防性维修识别码：项目经理C6349882
内政部： 10.1038/s41419-019-1361-3

长非编码RNA linc00665促进肺腺癌进展，并作为ceRNA通过海绵miR-98调节AKR1B10-ERK信号

庄庄聪等。细胞死亡病. 2019.

.2019年1月28日；10(2):84.

doi:10.1038/s41419-019-1361-3。

作者

庄庄聪¹, 逸飞雕², 杨旭^1 3, 李晓坤², 江志胜⁴, 陈业绍³, 赛光记⁴, 易神^5 6 7 8, 魏德⁹, 永强¹⁰

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¹南京大学医学院金陵医院心胸外科，210000，中国南京。
²东南大学金陵医院心胸外科，南京，210000。
³南京医科大学金陵医院心胸外科，南京，210000，中国。
⁴蚌埠医学院金陵医院心胸外科，233030，安徽。
⁵南京大学医学院金陵医院心胸外科，210000，南京，中国。dryishen@nju.edu.cn。
⁶东南大学金陵医院心胸外科，南京，210000。dryishen@nju.edu.cn。
⁷南京医科大学金陵医院心胸外科，南京，210000，中国。dryishen@nju.edu.cn。
⁸蚌埠医学院金陵医院心胸外科，233030，安徽。dryishen@nju.edu.cn。
⁹南京医科大学生物化学与分子生物学系，210000，南京，中国。
¹⁰南京大学医学院金陵医院心胸外科，210000，南京，中国。3947885@qq.com。

PMID： 30692511
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内政部： 10.1038/s41419-019-1361-3

摘要

长非编码RNA（lncRNAs）在多种恶性肿瘤中经常失调，这表明它们在肿瘤发生中具有潜在的致癌或抑癌作用。在此，我们报道了一种新的lncRNA，linc00665（ENST00000590622）的鉴定，它在肺腺癌组织中显著上调，可能是不良预后的独立预测因子。功能测试表明，linc00665在体内外增强了LUAD细胞的增殖和转移。从机制上讲，转录因子SP1诱导LUAD细胞中linc00665的转录，后者通过作为miR-98的竞争内源性RNA（ceRNA）发挥致癌作用，随后激活下游AKR1B10-ERK信号通路。总之，我们的研究阐明了linc00665-miR98-AKR1B10轴在LUAD肿瘤发生中的致癌作用，这可能是潜在的诊断生物标志物和治疗靶点。

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数字

**图1。LUAD中失调lncRNA的鉴定。**
一微阵列数据集GSE27262中差异表达lncRNA的聚类分析。b条通过qRT-PCR定量临床样本中lncRNA候选基因的相对表达水平。**c（c）**TCGA数据库中LUAD中linc00665的相对表达。总共有533个LUAD肿瘤组织和59个正常组织。d日通过Cancer RNA-seq Nexus分析来自TCGA的Linc00665表达数据。LUAD肺腺癌，TCGA癌症基因组图谱，qRT-PCR定量实时PCR

**图2。linc00665在LUAD组织和细胞中的表达。**
一Linc00665在LUAD标本中的表达显著高于邻近正常组织。b条–d日Linc00665在肿瘤大、TNM晚期和淋巴结转移患者中的表达显著较高。通过qRT-PCR检测Linc00665的表达，并将其归一化为GAPDH表达。**e（电子）**,**（f）**根据linc00665在80例LUAD患者中的表达对总生存率和无复发生存率进行Kaplan-Meier生存分析。克通过qRT-PCR测定非小细胞肺癌细胞系中linc00665相对于正常人支气管上皮细胞（16HBE）的丰度。小时linc00665在A549和H1299细胞中的亚细胞定位。U6和GAPDH分别作为细胞核和细胞质标记。我RNA FISH分析以确认linc00665在A549细胞中的亚细胞位置。U6和18S分别作为细胞核和细胞质标记。LUAD肺腺癌、NSCLC非小细胞肺癌、qRT-PCR定量实时PCR*第页 < 0.05, **第页 < 0.01

**图3。linc00665对体外LUAD细胞增殖、迁移、侵袭和EMT过程的影响。**
一通过qRT-PCR验证A549和H1299细胞中siRNA敲除和过度表达载体的效率。b条用linc00665 siRNA或过表达质粒转染A549和H1299细胞后进行CCK-8增殖检测。**c（c）**转染后A549和H1299细胞集落形成分析的代表性图像，更换培养基，每3天重复一次siRNA转染。d日划伤A549和H1299细胞后指定时间的伤口愈合分析的代表性图像。**e（电子）**,**（f）**转染后A549和H1299细胞跨孔迁移和侵袭检测的代表性图像。克迁移或入侵细胞数量的量化条形图。小时linc00665 siRNA转染A549和H1299细胞后E-cadherin、Vimentin、N-cadherin和GAPDH蛋白的表达。LUAD肺腺癌，NC阴性对照，qRT-PCR定量实时PCR*第页 < 0.05

**图4。在体外，敲除linc00665可促进细胞周期阻滞并诱导细胞凋亡。**
一,b条用linc00665 siRNA转染A549和H1299细胞后细胞周期分布的流式细胞术分析。**c（c）**,d日转染后A549和H1299细胞凋亡的流式细胞术分析。**e（电子）**linc00665 siRNA.NC阴性对照转染A549和H1299细胞后Bcl-2、Bax、Caspase-3、PARP和GAPDH蛋白的表达*第页 < 0.05, **第页 < 0.01

**图5。linc00665的下调抑制了体内LUAD肿瘤的生长和转移。**
一收集到的小鼠肿瘤的代表性图像。b条shRNA-NC或shRNA-Linc00665治疗后小鼠肿瘤体积曲线。**c（c）**代表肿瘤重量。d日通过qRT-PCR检测异种移植物肿瘤中linc00665的相对表达，并将其标准化为GAPDH。**e（电子）**异种移植瘤的组织病理学。肿瘤切片进行HE染色和Ki-67抗体免疫组化染色。**（f）**Ki-67指数计算为Ki-67阳性细胞的百分比。克肺转移的典型图像和切片的HE染色。转移用方框标记。比例尺 = 200 微米；NC阴性对照，HE-苏木精-伊红，qRT-PCR定量实时PCR**第页 < 0.05, ***第页 < 0.01

**图6。在LUAD细胞中鉴定AKR1B10作为linc00665的下游靶点。**
一通过RNA转录组测序分析linc00665敲除后A549细胞的基因表达谱。b条对所有表达改变的基因进行基因本体分析。**c（c）**在linc00665敲除后，通过qRT-PCR在A549细胞中选择性地确认基因mRNA水平的改变。d日在linc00665敲低或过度表达后，通过qRT-PCR证实A549和H1299细胞中AKR1B10的mRNA水平。**e（电子）**在linc00665敲低或过度表达后，通过western blot在A549和H1299细胞中确认AKR1B10的蛋白水平。**（f）**80例LUAD样本中linc00665和AKR1B10表达的相关性。克,小时用linc00665过表达质粒或AKR1B10 siRNA转染A549和H1299细胞后，跨孔侵袭检测的代表性图像和量化。我用linc00665过表达质粒或AKR1B10 siRNA转染A549和H1299细胞后进行CCK-8增殖检测。j个用linc00665过表达质粒或AKR1B10 siRNA转染A549和H1299细胞后，AKR1B10-ERK、p-ERK、MMP2、Vimentin和GAPDH蛋白的表达。原始未剪切的西部图像如补充图7所示。NC阴性对照、LUAD、肺腺癌、qRT-PCR定量实时PCR*第页 < 0.05, **第页 < 0.01

**图7。Linc00665通过竞争性结合miR-98上调AKR1B10。**
一80例LUAD样本中miR-98与linc00665或AKR1B10表达的相关性。b条linc00665敲低或过表达后A549和H1299细胞中miR-98的相对表达。**c（c）**用miR-98模拟物转染A549和H1299细胞后，相对linc00665或AKR1B10表达。d日推测miR-98与linc00665/AKR1B10的结合位点，野生型和突变型pmirGLO-linc00665/pmirGLO-AKR1B10结构的示意图。**e（电子）**miR-98 mimics或mimics NC和pmirGLO-linc00665-WT或pmirGLO-linc006665-MUT共同转染到293T、A549和H1299细胞中。检测到荧光素酶活性24 转染后h，采用双荧光素酶分析。**（f）**miR-98模拟物或模拟物NC和pmirGLO-AKR1B10-WT或pmirGLO-AKR1M10-MUT共同转染到293T、A549和H1299细胞中。检测到荧光素酶活性24 转染后h，采用双荧光素酶分析。克,小时进行生物素标记的RNA下拉测定，以证实在A549和H1299细胞中linc00665与miR-98的结合。在linc00665探针下拉颗粒中观察到大量linc00655和miR-98。我用miR-98模拟物、miR-98抑制剂或linc00665过表达质粒转染A549和H1299细胞后AKR1B10和GAPDH蛋白的表达。NC阴性对照，NS不显著，LUAD，肺腺癌*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页<0.001.

**图8。转录因子SP1上调了linc00665的表达。**
一,b条验证通过qRT-PCR和western Blot测定的A549细胞中SP1 siRNA敲除和过度表达载体效率。**c（c）**SP1 siRNA或过表达质粒转染A549细胞后linc00665的相对表达。d日采用ChIP法检测A549和H1299细胞中SP1蛋白与linc00665启动子的结合。**e（电子）**,**（f）**在SP1免疫沉淀物中检测到linc00665上游的序列–42至–33-bp，根据ChIP分析，当SP1在A549和H1299细胞中过度表达时，该序列进一步增强。克通过qRT-PCR检测80对LUAD组织中SP1 mRNA的表达水平。小时80例LUAD样本中SP1和linc00665表达的相关性。我LUAD细胞中基于linc00665的调节机制示意图。NC阴性对照，NS不显著，LUAD，肺腺癌，ChIP染色质免疫沉淀，qRT-PCR定量实时PCR**第页 < 0.01

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1. Torre LA等人，《2012年全球癌症统计》。加州癌症杂志临床。2015;65:87–108. doi:10.3322/caac.21262。-内政部-公共医学
1. Djebali S等人，《人类细胞转录的前景》。自然。2012;489:101–108. doi:10.1038/nature11233。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Mercer TR、Dinger ME、Mattick JS。长非编码RNA：功能洞察。Nat.Rev.基因。2009;10:155–159. doi:10.1038/nrg2521。-内政部-公共医学
1. Iyer MK等。人类转录组中长非编码RNA的景观。自然遗传学。2015;47:199–208. doi:10.1038/ng.3192。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[3] Torre LA等人，《2012年全球癌症统计》。加州癌症杂志临床。2015;65:87–108. doi:10.3322/caac.21262。-内政部-公共医学

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[7] Mercer TR、Dinger ME、Mattick JS。长非编码RNA：功能洞察。Nat.Rev.基因。2009;10:155–159. doi:10.1038/nrg2521。-内政部-公共医学

[8] Mercer TR、Dinger ME、Mattick JS。长非编码RNA：功能洞察。Nat.Rev.基因。2009;10:155–159. doi:10.1038/nrg2521。-内政部-公共医学

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