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.2019年1月26日；20(3):518.
doi:10.3390/ijms20030518。

PARP-1/2抑制剂奥拉帕利预防或部分逆转TGF-β诱导的NMuMG细胞EMT

米歇尔·沙克 1, 贾纳尼·库马尔 2, 尼古拉斯·科尔威尔 三, 科尔·赫尔曼森 4, 古斯塔沃A Folle 5, 谢尔盖·涅恰耶夫 6, 阿查纳·达萨拉蒂 7, 劳拉·拉丰·休斯 8
附属公司

PARP-1/2抑制剂奥拉帕利预防或部分逆转TGF-β诱导的NMuMG细胞EMT

米歇尔·沙克等。 国际分子科学杂志. .

摘要

聚二磷酸腺苷（ADP）-核糖（PAR）是一种由一些聚二磷酸核糖聚合酶（PARP）合成的翻译后修饰聚合物，即PARP-1、PARP-2、tankyrase-1和tankylase-2（TNKS-1/2）。PARP-1是核蛋白，在细胞外小泡中也被检测到。PARP-2和TNKS-1/2分布于细胞核和细胞质中。PARP或PAR在肿瘤中的改变已被描述，尤其是通过影响上皮-间充质转化（EMT），从而影响癌细胞的细胞迁移和耐药性。PARP-1的促EMT和抗EMT作用已被报道，而PAR变化是否在EMT期间特异性发生目前尚不清楚。PARP-1/2抑制剂Olaparib（OLA）被FDA批准用于治疗某些同源重组受损的癌症患者。在这里，我们研究了PAR变化和OLA对EMT的影响。拆卸PAR皮带时，EMT中的总PAR和核PAR增加。OLA可预防EMT，根据：（i）通过免疫细胞荧光/图像定量、Western blots和RNA定量评估的分子标记，（ii）表现为各向异性的形态变化，以及（iii）划痕试验中的迁移能力。OLA也部分逆转了EMT。即使在非BRCA（乳腺癌1基因）突变的癌症中，OLA也可能通过非常规作用机制发挥作用（与合成致死性不同）。

关键词：EMT；MEO328；PAR皮带；PARP；聚（ADP-核糖）；XAV939；肌动蛋白细胞骨架；各向异性；奥拉帕布。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图A1
图A1
NMuMG细胞拥有与肌动蛋白带密切相关的PAR带。
图A2
图A2
按照图顶部的时间表处理细胞，并对E-cadherin（红色）和细胞核（DAPI）进行成像。DAPI图像显示，在PARP抑制剂存在的情况下，与未经处理的细胞相比，细胞数量（存活率和毒性）没有显著损失。图像以20倍放大率拍摄。
图A3
图A3
使用与图3A相同的时间表，以10µM浓度使用所有抑制剂。对细胞进行胰蛋白酶消化，用台盼蓝染色，并使用Invitrogen计数细胞计数器进行计数，该计数器可区分活细胞和死细胞。将细胞绘制为活细胞总数（×105)每次治疗。实验重复三次，使用GraphPad Prism对对照处理细胞进行非配对t检验，以SEM表示。对细胞活力没有显著影响。
图1
图1
TGF-β诱导的NMuMG细胞各向异性随着核、细胞质和带状PAR的变化而增加。对照组的NMuMG细胞仅经历4小时的血清耗竭。在0.2%二甲基亚砜中加入或不加入20µM SB-431542（SB）的TGF-β（5 ng/mL，48 h）处理其他细胞。所有图像均为共焦单平面，并经历了比率为1的高斯模糊。顶部面板(A类–我). 列与处理相对应：控制(A类,D类,G公司)，转化生长因子-β(B类,E类,H（H）)和TGF-β+SB(C类,F类,我). 第一个原始显示合并+DAPI（蓝色）核复染(A类–C类). 用ENZO抗PAR抗体检测PAR（绿色；D类–F类)，F-actin，带罗丹明-类球蛋白探针（红色；G公司–我). 绿线表示各向异性的方向和大小。棒材：50µm。底部面板：控件(J型,M（M）,P（P）)，转化生长因子-β(K,N个,问)和TGF-β+SB(L（左）,O（运行）,R（右）). 第一行显示合并+DAPI（蓝色）核染色(J型–L（左）). 用BD抗PAR抗体检测PAR（绿色；M（M）–O（运行）)，F-actin，带罗丹明-类球蛋白探针（红色；P（P）–R（右）). 绿线表示各向异性的方向和大小。棒材：10µm（*）。图形显示控制和TGF-β图像量化数据。顶部，绿色条：总计(S公司)和核能(T型)PAR。用ENZO抗PAR抗体检测到的核PAR信号是使用强度比细胞核细胞质宏来测量的。总PAR量化为RawIntDen。PAR数据来自三个独立实验的七个堆栈中的至少58个平面。数据通过DAPI标准化（以避免不同微观场中可变细胞密度的偏差），并作为相应实验的百分比控制进行处理。平均值±SEM。底部橙色条：F-actin的各向异性测量(U型)或DAPI(V（V）)使用FibrilTool ImageJ宏的通道。TGF-β诱导的形态变化可以通过各向异性进行量化。F-actin图像的各向异性增加反映了上皮带的丢失和平行应力纤维的丰富。DAPI图像中各向异性增加是由于核形状从圆形变为卵圆形，以及核主轴平行于肌动蛋白应力纤维的位置。各向异性数据来自同两个独立实验的九个堆栈中的至少70个平面。平均值±SEM*第页< 0.05, **第页<0.01***第页< 0.001.
图2
图2
OLA阻止了EMT相关的形态学改变、E-cad减少和VIM增加。在50 nM OLA存在或不存在的情况下，用TGF-β（5 ng/mL）处理NMuMG细胞48 h，并用ICF评估其效果(A类–O（运行）)和图像量化(问–T型). 所有图像均为共焦单平面，并经历了比率为1的高斯模糊。列与控件相对应(A类,D类,G公司,J型,M（M）)，转化生长因子-β(B类,E类,H（H）,K,N个)和TGF-β+OLA(C类,F类,我,L（左）,O（运行）)治疗。行显示E cad(A类–C类)，用鬼笔肽-罗丹明检测F-肌动蛋白(D类–F类)、VIM(G公司–我)，DAPI复染色(J型–L（左）)，和合并的频道(M（M）–O（运行）). 棒材：10µm。绿线表示F-actin各向异性的方向和大小。实验时间表如所示(P），其中蓝色箭头表示时间轴（h）。剥夺血清4h后，同时加入TGF-β和OLA作为连续48h的治疗。不仅是典型的EMT标记E-cad(问)和VIM(R（右）)还有形态的变化(S）受到低OLA浓度的显著影响，表明PAR总降低趋势(T型). PAR（10个堆栈中的n>70个平面）和E-cadherin（20个堆栈中n>150个平面）数据来自四个独立的实验。VIM（来自10个堆栈的n>98个平面）在三个独立实验中进行了量化。所有强度数据均作为相应实验的百分比控制进行处理，并表示为平均百分比控制±SEM。F-actin各向异性数据来自三个独立的实验。在对20个控制堆栈和>40个TGF-β或TGF-？+OLA堆栈进行高斯模糊处理后，使用每个堆栈中具有较高F-actin信号的三个平面对各向异性进行量化(第页=1）过滤操作。数据被处理为绝对数，仅为视觉清晰度而表示为平均百分比对照±SEM。统计比较涉及对照与TGF-β（TGF-β条上的星号）以及TGF-β与TGF-β+OLA（TGF-β+OLA条上的星号）*第页< 0.05, **第页<0.01***第页< 0.001.
图3
图3
EMT可通过PARP-1/2抑制剂OLA和PARP-3抑制剂MEO预防，但不能通过TNKS抑制剂XAV预防。此外，根据实验时间表，添加了10µM的每种PARP抑制剂(A类)TGF-β（5 ng/mL）处理NMuMG细胞48小时前1小时，E-钙粘蛋白mRNA相对于18S rRNA的倍数增加(B类)通过RT-PCR和WB评估E-钙粘蛋白相对于肌动蛋白的增加(C类). TGF-β治疗48小时后的伤口t吨=0，6小时后评估(D类)或15小时后(E类)并使用“MRI伤口愈合”Image J插件测量细胞迁移，比较时间=0和愈合6或15小时后的图像。数据是至少三个独立生物复制的平均值，用SEM表示。使用GraphPad Prism 7软件进行统计分析（t检验），将每个处理与对照进行比较*第页< 0.05, **第页<0.01***第页< 0.001, ****第页<0.0001，ns=不显著。ICF概述见图A2，台盼蓝染料排斥细胞活力测定见图A3。
图4
图4
延长OLA治疗后，EMT至少部分恢复。左侧和顶部：在过去24小时内，在有或无50 nM OLA的情况下，用TGF-β（5 ng/mL）处理NMuMG细胞72小时（计划一)，并通过ICF评估效果(A类–X（X）)和图像量化(b条–d日). ICF：列对应于控件(A类,D类,G公司,J型;M（M）,P（P）,S公司,V（V）)，转化生长因子-β(B类,E类,H（H）,K;N个,问,T型,W公司)和TGF-β+OLA(C类,F类,我,L（左）;O（运行）,R（右）,U型,X（X）)治疗。行显示E cad(A类–C类)，F-肌动蛋白用指骨苷-罗丹明检测(D类–F&P公司–R（右）)、VIM(G公司–我)，合并+DAPI计数器染色(J型–L&M公司–O（运行）)，PAR(S公司–U型)和文丘林(V（V）–X（X）). 棒材：10µm。绿线表示F-actin各向异性的方向和大小。所有图像均为共焦单平面，并经历了比率为1的高斯模糊。左上面板(A类–L（左）)Photoshop在每个通道的单个操作中人为地增加亮度，以便于可视化，而不影响不同处理之间的强度比较。图像量化结果：E-cadherin(b条)和VIM(c）从单个实验的相同样本中并行测量(n个>四层或五层的50个平面）。F-actin各向异性(d日)和PAR强度数据(e（电子）)来自两个独立的实验。在10个控制堆栈和20个TGF-β或TGF-？+OLA堆栈上量化各向异性。分别在70个对照组和>200个TGF-β或TGF-α+OLA平面的5个或16个堆栈中测量PAR（BD）。右下角(如果–小时)：在过去48小时内，在有或无50 nM OLA的情况下，用TGF-β（5 ng/mL）处理NMuMG细胞96小时（计划如果). 在延长TGF-β治疗期间，许多细胞脱落。通过ICF和图像定量评估对附着细胞的影响。F-actin各向异性和β-catenin强度数据来自两个独立的实验。对26个对照组和32个TGF-β或TGF-β+OLA组的各向异性进行量化。β-catenin在>20个堆栈中的>200个平面上测量。所有强度数据均作为相应实验的百分比控制进行处理，并表示为平均百分比控制±SEM。在对每个叠加的三个平面进行高斯模糊处理后，用较高的F-actin信号量化各向异性(第页=1）过滤操作。各向异性数据被处理为绝对数，并表示为平均百分比控制±SEM的视觉清晰度*第页< 0.05, **第页<0.01***第页< 0.001. F-actin各向异性测量中反映的细胞形态和细胞骨架变化以及波形蛋白或β-catenin信号的变化强烈表明，OLA（如预期的那样诱导PAR总量减少）可以逆转TGF-β效应。在短暂的OLA后处理（a）后，E-cadherin的减少没有恢复，这增加了部分EMT恢复的可能性。
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