Thioridazine Enhances P62-Mediated Autophagy and Apoptosis Through Wnt/β-Catenin Signaling Pathway in Glioma Cells

doi:10.3390/ijms20030473

.2019年1月22日；20(3):473.

doi:10.3390/ijms20030473。

硫哒嗪通过Wnt/β-连环蛋白信号通路增强P62介导的胶质瘤细胞自噬和凋亡

程伟初^1 2, 惠久阁^三, 周嘉华⁴, 泰山城⁵, 惠文成⁶, 于洪亮⁷, 赖云玲⁸, 陈延林⁹, 王池惠¹⁰, Joon Khim Loh公司^11 12 13, Jiin-Tsuey Cheng先生¹⁴, Shean-Jaw Chiou先生^15 16 17, 苏春丽¹⁸, Chi-Ying F黄^19 20, 伊仁宏^{21 22 23 24}

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硫瑞达嗪通过Wnt/β-儿茶酚胺信号通路增强胶质瘤细胞P62介导的自噬和凋亡

程伟初等。国际分子科学杂志. 2019.

.2019年1月22日；20(3):473.

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PMID： 30678307
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摘要

噻嗪（THD）是一种常见的吩噻嗪类抗精神病药物，据报道可抑制几种类型癌细胞的生长。我们之前已经证明THD可以作为一种抗胶质母细胞瘤和抗癌干细胞样细胞剂。然而，自噬和细胞凋亡诱导的信号通路尚不清楚。THD治疗显著诱导自噬，AMPK活性上调，并导致多形性胶质母细胞瘤（GBM）细胞株中G1亚群增加导致细胞死亡。值得注意的是，通过THD治疗的全基因表达筛选，发现了一个G蛋白偶联受体家族的frizzled（Fzd）蛋白，表明Wnt/β-catenin信号参与。THD处理后，Fzd-1和GSK3β-S9磷酸化（失活形式）降低，以促进β-catenin降解，从而减弱P62抑制。当P62从β-catenin抑制中释放出来时，自噬标记物LC3-II显著增加。此外，通过抑制T细胞因子/β-连环蛋白和自噬流量，证实了P62依赖性caspase-8激活可诱导P53非依赖性凋亡。此外，THD联合替莫唑胺（TMZ）治疗可增加LC3-II的表达和caspase-3的活性，显示出良好的药物协同作用。总之，THD不仅通过上调AMPK活性诱导GBM细胞自噬，而且通过Wnt/β-catenin信号增强P62介导的自噬和凋亡。因此，THD是GBM中药物重新定位的潜在替代治疗剂。

关键词：第62页；Wnt/β-catenin；细胞凋亡；自噬；胶质母细胞瘤；硫利达津。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。资助者在研究设计中没有任何作用；收集、分析或解释数据；撰写手稿时；或者在决定公布结果时。

数字

图1
噻哒嗪（THD）和THD类似物治疗对多形性胶质母细胞瘤（GBM）细胞具有抑制作用。(A类)THD的结构和THD类似物的对映体；(B类)采用硫罗丹明B（SRB）法评估GBM8401和U87MG细胞的细胞活力。24小时药物治疗后，IC₅₀使用GraphPad Prism计算药物值（THD类似物-1和类似物-2是外消旋化合物）。集成电路概述₅₀表中提供了值；(C类)通过克隆形成试验评估THD和THD类似物对GBM8401细胞克隆形成的影响。IC₅₀所有药物的值均小于10µM；(天)分别以5、7.5、10和15µM的不同THD类似物处理GBM8401细胞24小时。用Western blotting检测p-AMPK（Thr172）、AMPK、LC3I和LC3-II。α-管蛋白被用作内部对照；(E类)THD抑制胶质瘤细胞系的增殖。用不同浓度的THD处理U87MG和GBM8401细胞24小时；(F类)将细胞在THD（15µM）存在下培养8、16和24小时，然后使用CCK-8分析评估细胞活力。条形图表示三倍±SD的平均值*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页与对照组相比<0.001。

图2
THD诱导GBM细胞凋亡。(A类)用5或15µM的THD处理U87MG和GBM8401细胞24 h，并用50µg/mL PI染色通过流式细胞术定量细胞周期变化；(B类)U87MG和GBM8401细胞用5、10或15µM的THD处理24小时，并通过使用FITC膜联蛋白V凋亡检测试剂盒（BD PharmingenTM，目录556547）通过流式细胞术定量凋亡细胞百分比。PI（y轴）与膜联蛋白V（x轴）的代表性散点图。

图3
THD诱导GBM细胞自噬和凋亡。(A类)用指示浓度的THD处理细胞24小时，并用Bax、Bcl-xL、P53、P53（Ser15）和p21抗体进行免疫印迹；(B类)用THD处理细胞24小时，并进行Western blotting以评估自噬相关蛋白、P62和beclin-1；(C类)TMZ和THD联合治疗可诱导GBM细胞AMPK激活和自噬。用200µM TMZ和不同剂量的THD处理U87MG细胞24小时。使用Western blotting检测p-AMPK（Thr172）、AMPK、caspase-3、c-caspase-2、LC3-I和LC3-II。β-actin和GAPDH被用作内部对照。条形图表示三倍±SD的平均值*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页与对照组相比<0.001。^## 第页< 0.01,^### 第页<0.001表明TMZ（200µM）与车辆相比。

图4
GPCR的目标是THD。(A类)使用ConsensusPathDB通路分析仪，使用两个数据库来确定THD诱导自噬和凋亡的可能途径。最重要的途径包括癌症相关途径、G蛋白偶联蛋白信号传导、衰老和自噬、DNA损伤反应以及G1-S细胞周期控制；(B类)在GBM8401和U87MG上验证候选蛋白Fzd1，并用5、10或15µM THD处理24小时。GAPDH被用作内部控制。条形图表示三倍±SD的平均值*第页< 0.05, **第页与对照组相比<0.01。

图5
THD通过Wnt/β-catenin信号通路介导β-catentin降解。(A类)用5、10或15µM THD处理GBM细胞24 h，并测定Wnt途径的蛋白表达模式；(B类)将GBM细胞与不同浓度的THD和MG-132（10µM）孵育24 h。制备细胞溶胶部分，并用GSK3β、S9 GSK3α、β-catenin、S33/37/41-β-catening和P62抗体进行Western印迹。β-actin作为内部对照。条形图表示三倍±SD的平均值*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页与对照组相比<0.001。

图6
Fzd/GSK3β/β-catenin/P62轴串扰THD模型。一个总结了各种研究中获得的可能途径的工作模型（参考文献[10，21]和本研究）揭示了一种调节反馈机制，该机制将β-连环蛋白-LC3 II/P62-半胱氨酸-8置于增殖、自噬和凋亡的循环中，这对THD抗精神病药靶向GBM细胞的这些途径以治疗THD具有意义。路线1，无THD；路线2，带THD；红色虚线表示可能的机制（有关详细信息，请参阅讨论部分3。）。

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