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.2019年1月23日；9(1):323.
doi:10.1038/s41598-018-36911-1。

黄芪甲苷IV通过SIRT-NF-κB p65轴的自噬增强抑制葡萄糖诱导的足细胞上皮-间充质转化

王晓雷 1 2, 高彦斌（Yanbin Gao） 三 4, 田念秀 1 2, 王涛（音译） 1, 施益民 2, 徐嘉怡 1, 吴炳杰 1
附属公司

黄芪甲苷IV通过SIRT-NF-κB p65轴的自噬增强抑制葡萄糖诱导的足细胞上皮-间充质转化

王晓雷等。 科学代表. .

摘要

自噬和足细胞-上皮-间充质转化（EMT）是涉及蛋白尿和纤维化的肾小球疾病的关键因素。在此，我们试图确定植物源皂苷黄芪甲苷IV（AS-IV）是否能够通过调节自噬和足细胞EMT逆转肾纤维化并改善肾功能。将培养的永生化小鼠足细胞和KK-Ay小鼠糖尿病模型暴露于AS-IV。采用免疫印迹、实时PCR、免疫荧光和组织化学方法分析自噬标记物和足细胞EMT。我们观察到，AS-IV通过降低NF-κB亚基p65乙酰化以及增加Sirtuin（SIRT1）的表达，抑制了葡萄糖诱导的足细胞EMT并增强了自噬。用SIRT1抑制剂EX527处理细胞和动物模型能够逆转这些效应。SIRT1激活剂SRT1720还可降低葡萄糖诱导足细胞EMT中p65乙酰化并增强自噬。此外，进一步用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤治疗能够逆转AS-IV对足细胞EMT的影响，而自噬激活剂雷帕霉素或NF-κB通路抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸铵（PDTC）能够逆转葡萄糖诱导的足细胞EMT。值得注意的是，经AS-IV治疗后，糖尿病KK-Ay小鼠的肾纤维化和肾功能均得到改善。这些发现支持AS-IV作为一种肾保护剂，可能通过调节SIRT1-NF-κB通路和自噬激活对足细胞EMT产生影响。需要进一步研究来阐明AS-IV作为肾小球疾病潜在治疗剂的作用。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
AS-IV对高血糖引发的足细胞EMT的作用。(A类)AS-IV化学结构。(B–E类)足细胞用高/正常葡萄糖预处理1 小时，然后用或不用AS-IV（25、50和100）培养 μM）用于48 小时。(B类)实时PCR检测TGF-βmRNA表达水平。(C类)用Western blotting定量TGF-β蛋白水平。(D类)实时PCR检测α-SMA、N-cadherin、E-cadherin和nephrin的mRNA表达水平。(E类)用Western blotting检测α-SMA、N-cadherin、E-cadherin和nephrin的蛋白水平。注：E-Ca、E-cadherin；N-Ca，N-cadherin。蛋白质的分子量：TGF-β，44 kDa；尼泊林，100 kDa；E-钙粘蛋白，110 kDa；N-钙粘蛋白，100 kDa；α-SMA，42 kDa。数据表示为平均值 ± 标准偏差 = 3.*与正常血糖队列或AS-IV队列相比，P < 0.05;#与高糖队列相比，P < 0.05.
图2
图2
体内AS-IV对足细胞EMT的影响。α-SMA和nephrin水平体内用免疫荧光法进行分析，并用Western blotting定量TGF-β、N-钙粘蛋白和E-钙粘蛋白的水平。数据表示为平均值 ± 标准偏差 = 3.*与正常对照队列或AS-IV治疗队列相比，P < 0.05之间。
图3
图3
体外AS-IV对高血糖诱发足细胞EMT中SIRT1和NF-kB p65表达的影响。(A–F)足细胞在1 暴露于高血糖条件下1小时，随后用或不用AS-IV（100 μM）用于48 小时。(A类,E类)使用实时PCR定量SIRT1和p65的mRNA表达水平。(B类)SIRT1活性测定检测SIRT1的脱乙酰酶活性。(C类,D类,F类)用Western blotting定量SIRT1和AC-p65的蛋白水平。蛋白质的分子量：SIRT1110 kDa；AC-p65、65 kDa；第65、65页 kDa。数据表示为平均值 ± 标准偏差 = 3.*与正常血糖队列、AS-IV队列、高糖+AS-IV组、高糖+SRT1720组相比，P < 0.05;#与高糖加AS-IV队列相比，P < 0.05. (G公司)足细胞用高糖预处理1 小时，然后与PDTC或AS-IV孵育48小时 小时。用Western blotting定量TGF-β、nephrin、E-cadherin、N-cadherin和α-SMA的水平。数据表示为平均值 ± 标准差n = 3.*与正常血糖队列、高糖加AS-IV队列或高糖加PDTC队列相比，P < 0.05.
图4
图4
体内AS-IV对SIRT1和NF-kB p65表达的影响。(A类,B类)AC-p6和SIRT1的水平体内免疫荧光分析。
图5
图5
AS-IV对SIRT1诱导的NF-κB信号失活的影响导致高血糖触发足细胞EMT中的自噬。在高血糖条件下暴露一小时后，用EX527或SRT1720预处理足细胞，然后用或不用AS-IV（100 μM）用于48 小时。Beclin 1和LC3II蛋白水平通过Western blotting定量。蛋白质的分子量：LC3 II，16 kDa；贝克林1，60 kDa。数据表示为平均值 ± 标准偏差 = 3.*与正常血糖队列、AS-IV队列、高糖+AS-IV组、高糖+SRT1720组相比，P < 0.05;#与高糖加AS-IV队列相比，P < 0.05.
图6
图6
AS-IV诱导的自噬对高血糖触发足细胞EMT的影响。(A类,B类)高血糖暴露后用雷帕霉素或3-MA处理足细胞，然后用或不用AS-IV（100 μM）用于48 小时(A类)使用实时PCR定量TGF-β、nephrin E-钙粘蛋白、α-SMA和N-钙粘蛋白的mRNA水平。(B类)Western blotting检测TGF-β、nephrin E-cadherin、N-cadherin和α-SMA的蛋白水平。数据表示为平均值 ± 标准偏差 = 3.*与正常血糖队列、高糖加AS-IV队列或高糖加雷帕霉素队列相比，P < 0.05;#与高糖加AS-IV队列相比，P < 0.05.
图7
图7
AS-IV对糖尿病KK-Ay小鼠肾功能和形态的影响。(A类,B类)通过ACR和mAlb水平评估肾功能。(C类)使用光学和电子显微镜（EM）观察肾脏形态。EM、苏木精-伊红（HE）、masson和周期性酸性雪夫（PAS）染色的代表性照片。(D类)AS-IV对糖尿病KK-Ay小鼠Col-IV和FN表达的影响。IHC的代表性照片描述为FN和col-IV。数据表示为平均值 ± 标准偏差 = 12.*与正常对照队列或AS-IV治疗队列相比，P < 0.05.
图8
图8
描绘AS-IV在高血糖触发的足细胞EMT中的拟议作用的图表。为了应对高糖的有害刺激，足细胞进行EMT。在这种状态下，SIRT1表达减少，这进一步导致去乙酰化活性受到抑制。NF-kB亚单位p65进入细胞核并被乙酰化（AC-p65）。AC-p65表达增加导致自噬减少。AS-IV处理增加SIRT1的表达，导致脱乙酰活性增加。因此AC-p65下调，从而增加自噬水平。因此，AS-IV可以通过NF-kB p65亚单位的SIRT1脱乙酰化增强自噬来改善足细胞EMT。
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