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.2019年1月24日；4（2）：e125490。
doi:10.1172/jci.insight.125490。

上皮天然免疫介导肾损伤后肾小管细胞衰老

恒进 1 2, 张燕（音译） 1 2, 琼丁 1, 王珊珊 三, 普雷纳·拉斯托吉 4, 道孚代 4, 东美路 5, 麦迪逊·普维斯 1, 曹超 1 2, 王诗龄 1, 刘丁晓 1, 任崇玉 5, 莎拉·埃尔哈迪 5, 胡明昌 5, 延汾柴 2, 戴安娜·泽佩达·奥罗佐 6, 朱迪斯·坎皮西 7, 马西莫·阿塔纳西奥 1
附属机构

上皮天然免疫介导肾损伤后肾小管细胞衰老

恒进等。 JCI洞察力. .

摘要

急性肾损伤（AKI）是一种发病率不断上升的常见临床症状。患有严重急性肾损伤的患者在以后的生活中发生间质纤维化、慢性肾脏疾病和终末期肾脏疾病的风险更高。细胞衰老是一种持续的细胞周期阻滞和多种应激源引起的基因表达模式改变。衰老细胞的数量随着年龄的增长而增加，即使数量很少，这些细胞也会导致慢性炎症和纤维化；事实上，在包括肾脏在内的多个器官中，这些细胞的积累是衰老的标志。我们假设肾损伤后可能会导致细胞衰老，这可能会导致器官纤维化。为了验证这一假设，我们发现小鼠肾损伤后几天内肾小管上皮细胞（TEC）衰老，这种反应是由先天免疫系统的上皮Toll样和白细胞介素1受体（TLR/IL-1R）介导的。通过敲除髓样分化88（Myd88）对小鼠天然免疫信号的上皮细胞特异性抑制减少了纤维化和肾小管损伤，也阻止了衰老TEC的积累。重要的是，虽然损伤后灭活Myd88可以改善纤维化，但并不能减少对肾小管的损伤。通过两种不同的方法选择性诱导衰老细胞凋亡，只能部分减轻肾纤维化，而不能改善肾小管的损伤。我们的数据揭示了上皮天然免疫在控制肾损伤后TEC衰老中的细胞自主作用，此外还表明需要早期治疗干预才能有效减少AKI的长期后遗症。

关键词：细胞周期；细胞衰老；慢性肾脏疾病；炎症；肾脏学。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：提交人声明，不存在利益冲突。

数字

图1
图1。AKI诱导肾小管细胞衰老。
(A类–C类)损伤后28天，3种AKI小鼠模型（FA、IRI和CP）肾脏的SA-β-Gal染色与对照组和相对定量比较(D类–F类). 比例尺：500μm。(G公司–我)FA、IRI和CP后28天LAMNB1的代表性免疫荧光共聚焦图像，以及LAMNB1-阳性细胞的相关数字图像分析鉴定(J型–L（左）). 比例尺：20μm。数据表示为平均值±标准偏差。P（P）使用双尾Student’st吨测试。每只鼠标十幅图像。每个面板上都标明了实验小鼠的数量。
图2
图2。肾小管细胞的细胞衰老是AKI后的早期事件。
(A类)共聚焦显微镜图像p16-3磁共振–FA损伤后14天的转基因肾脏（左）和车辆注射对照（右）。比例尺：2 mm(B类)肾切片的共焦显微镜图像p16-3磁共振–FA损伤后14天，转基因肾脏显示mRFP表达细胞与近端肾小管标记物LTL共定位。比例尺：50μm。(C类)外植体的荧光图像p16-3磁共振–FA损伤后28天的转基因肾脏（上部）和对照（下部），以及(D类)足总损伤后不同时间点的量化。n个=每组7只小鼠/时间点。所有数据均以平均值±SD表示。P（P）使用双尾Student’s计算值t吨测试。
图3
图3。上皮细胞特异性缺失Myd88（Myd88）减少FA损伤后促炎细胞因子的表达。
(A类–E类)IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和(F类)在FA损伤28天后通过实时定量PCR测定分离的肾小管细胞中周细胞活化配体Shh的含量Ksp-核心Myd88（Myd88）飞行/飞行小鼠与Ksp-核心Myd88（Myd88）+/+控制。实验小鼠的数量显示在相应的面板中。数据表示为平均值±标准偏差。P（P）使用双尾Student’st吨测试。
图4
图4。衰老的肾小管细胞是纤维化前Hedgehog配体的来源。
(A类和B类)mRFP中Shh和Ihh的相对表达富集+与mRFP比较的单元格–FA损伤后14天来自同一肾脏的细胞。实验小鼠的数量显示在相应的面板中。数据表示为平均值±标准偏差。P（P）使用双尾Student’st吨测试。
图5
图5。上皮细胞特异性缺失Myd88（Myd88）减少肾脏损伤和纤维化。
(A类)低（上图）和高（下图）放大率下三色染色肾脏的代表性图像Ksp-核心Myd88（Myd88）飞行/飞行小鼠与Ksp克里Myd88（Myd88）+/+足总受伤28天后进行对照。比例尺：500μm（上）和200μm（下）。(B类)胶原蛋白/总蛋白含量比率和(C类)肾皮质胶原1 mRNA水平的实时定量PCRKsp-核心Myd88（Myd88）飞行/飞行FA损伤28天后，小鼠与对照组进行比较。(D类)典型的免疫荧光共焦图像Ksp-核心Myd88（Myd88）飞行/飞行FA损伤28天后，与对照组相比，对小鼠肾脏进行成纤维细胞标记物FSP1的免疫染色，以及(E类)通过数字图像分析进行相应的量化。比例尺：20μm。(F类)典型的免疫荧光共焦图像Ksp-核心Myd88（Myd88）飞行/飞行FA损伤28天后，与对照组相比，对小鼠肾脏进行肌成纤维细胞标记物α-SMA的免疫染色，以及(G公司)通过数字图像分析进行相应的量化。比例尺：20μm。(H（H）)典型的免疫荧光共焦图像Ksp-核心Myd88（Myd88）飞行/飞行FA损伤28天后，与对照组相比，对小鼠肾脏进行巨噬细胞标记物F4/80的免疫染色，以及(我)通过数字图像分析进行相应的量化。比例尺：20μm。(J型)PAS染色肾脏在低（上面板）和高（下面板）放大率下的代表性图像Ksp-核心Myd88（Myd88）飞行/飞行FA损伤28天后，小鼠与对照组进行比较。比例尺：500μm（上部）和200μm（下部）。(K（K）)肾小管损伤评分Ksp-核心Myd88（Myd88）飞行/飞行FA损伤28天后，小鼠与对照组进行比较。每个小组都报告了小鼠的实验数量。(L（左）)Kaplan-Meier曲线Ksp克里Myd88（Myd88）飞行/飞行小鼠与对照组进行比较。面板中显示的实验小鼠数量。(M（M）)FA损伤后不同时间点的血清肌酐测定Ksp-核心我的88飞行/飞行小鼠与对照组进行比较。n个=每个时间点7只老鼠。数据表示为平均值±标准偏差。P（P）使用双尾学生的t吨测试。
图6
图6。上皮细胞特异性缺失Myd88（Myd88）减少肾小管细胞的衰老。
(A类)肾脏SA-β-Gal活性染色的代表性图像，低倍放大（上面板）和高倍放大（下面板）Ksp-核心Myd88（Myd88）飞行/飞行小鼠与Ksp-核心Myd88（Myd88）+/+FA受伤28天后进行控制，以及(B类)通过数字图像分析进行相应的量化。比例尺：500μm（上部）和200μm（下部）。(C类)典型的免疫荧光共焦图像Ksp-核心Myd88（Myd88）飞行/飞行FA损伤28天后，与对照组相比，用抗LAMNB1抗体检测小鼠肾脏，以及(D类)相应的量化。比例尺：20μm。(E类)典型的免疫荧光共焦图像Ksp-核心Myd88（Myd88）飞行/飞行FA损伤28天后，与对照组相比，用抗增殖标记物Ki67的抗体检测小鼠肾脏，以及(F类)相应的量化。比例尺：20μm。每个小组报告实验小鼠的数量。每只鼠标10个图像。数据表示为平均值±标准偏差。P（P）使用双尾Student’st吨测试。
图7
图7。上皮细胞特异性缺失Myd88（Myd88）损伤后减少肾小管细胞的衰老。
(A类)三苯氧胺诱导Cre转基因表达方案示意图KspCre-ERT2公司Myd88（Myd88）飞行/飞行老鼠。TMX，三苯氧胺；PBS，磷酸盐缓冲盐水。(B类)肾脏SA-β-Gal活性染色的代表性图像，低倍放大（上面板）和高倍放大（下面板）KspCre-ERT2公司Myd88（Myd88）飞行/飞行小鼠与对照组的比较(KspCre-ERT2公司Myd88（Myd88）+/+)足总受伤后28天，以及(C类)相应的数字图像分析。比例尺：500μm（上部）和200μm（下部）。(D类)典型的免疫荧光共焦图像KspCre-ERT2公司Myd88（Myd88）飞行/飞行FA损伤28天后，与对照组相比，用抗LAMNB1抗体检测小鼠肾脏，以及(E类)相应的量化。比例尺：20μm。(F类)典型的免疫荧光共焦图像KspCre-ERT2公司Myd88（Myd88）飞行/飞行FA损伤28天后，与对照组相比，用抗增殖标记物Ki67的抗体探测小鼠肾脏，并且(G公司)相应的量化。比例尺：20μm。每个小组报告实验小鼠的数量。每只鼠标十幅图像。数据表示为平均值±标准偏差。P（P）使用双尾Student’st吨测试。
图8
图8。上皮细胞特异性缺失我的88损伤后可减少纤维化，但不能保护肾小管免受损伤。
(A类)在低（上面板）和高（下面板）放大倍数下，经毛发染色的肾脏的代表性图像KspCre-ERT2公司Myd88（Myd88）飞行/飞行小鼠与KspCre-ERT2公司Myd88（Myd88）+/+足总受伤28天后进行对照。比例尺：500μm（上部）和200μm（下部）。(B类)胶原蛋白/总蛋白含量比率和(C类)肾皮质胶原1 mRNA水平的实时定量PCRKspCre-ERT2公司Myd88（Myd88）飞行/飞行FA损伤28天后，小鼠与对照组进行比较。(D类)典型的免疫荧光共焦图像KspCre-ERT2公司Myd88（Myd88）飞行/飞行FA损伤28天后，与对照组相比，对小鼠肾脏进行成纤维细胞标记物FSP1的免疫染色，以及(E类)通过数字图像分析进行相应的量化。比例尺：20μm。(F类)典型的免疫荧光共焦图像KspCre-ERT2公司Myd88（Myd88）飞行/飞行FA损伤28天后，与对照组相比，对小鼠肾脏进行肌成纤维细胞标记物α-SMA免疫染色，以及(G公司)通过数字图像分析进行相应的量化。比例尺：20μm。(H（H）)典型的免疫荧光共焦图像KspCre-ERT2公司Myd88（Myd88）飞行/飞行FA损伤后28天，小鼠肾脏对巨噬细胞标记物F4/80进行免疫染色，并与对照组进行比较(我)通过数字图像分析进行相应的量化。比例尺为20μm。(J型)PAS染色肾脏在低（上面板）和高（下面板）放大率下的代表性图像KspCre-ERT2公司我的88飞行/飞行FA损伤28天后，小鼠与对照组进行比较。比例尺：500μm（上部）和200μm（下部）。(K（K）)管状损伤评分KspCre-ERT2公司Myd88（Myd88）飞行/飞行小鼠在FA损伤后28天与对照组进行比较。每个小组都报告了小鼠的实验数量。数据表示为平均值±标准偏差。P（P）使用双尾学生的t吨测试。
图9
图9。AKI后，衰老细胞的基因清除可改善间质纤维化，但不能改善肾小管损伤。
(A类)更昔洛韦给药诱导FA损伤的衰老细胞清除方案示意图p16-3磁共振老鼠。GCV，更昔洛韦；PBS，磷酸盐缓冲盐水。(B类)FA损伤后28天，GCV治疗组小鼠与PBS治疗组对照组小鼠在低倍（上片）和高倍（下片）放大下的毛发染色肾脏的代表性图像。比例尺：500μm（上部）和200μm（下部）。(C类)胶原蛋白/总蛋白含量比率和(D类)FA损伤28天后GCV治疗和车辆治疗小鼠肾皮质中胶原蛋白1 mRNA水平的实时定量PCR。(E类)FA损伤28天后，与对照组相比，GCV处理的小鼠肾脏免疫染色成纤维细胞标记物FSP1的代表性免疫荧光共聚焦图像，以及(F类)通过数字图像分析进行相应的量化。比例尺：20μm。(G公司)FA损伤28天后，与对照组相比，GCV治疗小鼠肾脏巨噬细胞标记物F4/80免疫染色的代表性免疫荧光共聚焦图像，以及(H（H）)通过数字图像分析进行相应的量化。比例尺：20μm。(我)与FA损伤28天后的对照组相比，GCV治疗小鼠肾脏的肌成纤维细胞标记物α-SMA免疫染色的代表性免疫荧光共聚焦图像，以及(J型)通过数字图像分析进行相应的量化。比例尺：20μm。(K（K）)与FA损伤28天后的对照组相比，GCV治疗组小鼠在低（上面板）和高（下面板）放大率下PAS染色肾脏的典型图像。比例尺：500μm（上部）和200μm（下部）。(L（左）)FA损伤28天后，GCV治疗组小鼠与对照组小鼠的肾小管损伤评分比较。每个小组都报告了小鼠的实验数量。数据表示为平均值±标准偏差。P（P）使用双尾Student’st吨测试。
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