An Exonic Switch Regulates Differential Accession of microRNAs to the Cd34 Transcript in Atherosclerosis Progression

doi:10.3390/genes10010070

.2019年1月21日；10(1):70.

doi:10.3390/genes10070。

外显子开关调节微RNA对动脉粥样硬化进展中Cd34转录物的差异性连接

米盖尔·休索¹, 约塞普·M·克鲁扎多², 琼·托拉斯^三, 埃斯塔尼斯·纳瓦罗⁴

附属公司

¹西班牙巴塞罗那L'Hospitalet de Llobregat大学贝尔维奇医院和贝尔维奇研究所（IDIBELL）肾脏科，08907。mhueso@idibell.cat。
²西班牙巴塞罗那L'Hospitalet de Llobregat大学贝尔维奇医院和贝尔维奇研究所（IDIBELL）肾脏科，08907。jmcruzado@bellvitgehospital.cat。
^三西班牙巴塞罗那L'Hospitalet de Llobregat大学贝尔维奇医院和贝尔维奇研究所（IDIBELL）肾脏科，08907。15268jta@comb.cat。
⁴西班牙巴塞罗那08950 Esplugues de Llobregat独立研究员。estanis.navarro@gmail.com。

PMID： 30669689
预防性维修识别码： PMC6356495型
内政部： 10.3390/发电机10010070

外显子开关调节微RNA对动脉粥样硬化进展中Cd34转录物的差异性连接

米盖尔·休索等。基因（巴塞尔）. 2019.

.2019年1月21日；10(1):70.

doi:10.3390/genes10070。

作者

米盖尔·休索¹, 约瑟普·克鲁扎多², 琼·托拉斯^三, 埃斯塔尼斯·纳瓦罗⁴

附属公司

¹西班牙巴塞罗那L'Hospitalet de Llobregat大学贝尔维奇医院和贝尔维奇研究所（IDIBELL）肾脏科，08907。mhueso@idibell.cat。
²西班牙巴塞罗那L'Hospitalet de Llobregat大学贝尔维奇医院和贝尔维奇研究所（IDIBELL）肾脏科，08907。jmcruzado@bellvitgehospital.cat。
^三西班牙巴塞罗那L'Hospitalet de Llobregat大学贝尔维奇医院和贝尔维奇研究所（IDIBELL）肾脏科，08907。15268jta@comb.cat。
⁴西班牙巴塞罗那08950 Esplugues de Llobregat独立研究员。estanis.navarro@gmail.com。

PMID： 30669689
预防性维修识别码： PMC6356495型
内政部： 10.3390/发电机10010070

摘要

背景：CD34型⁺ 内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells，EPCs）在受损内皮细胞的恢复中起着重要作用，并参与动脉粥样硬化（ATH）的发病机制。之前我们描述了miR-125的潜在致动脉粥样硬化作用，我们在本研究中旨在证实这一作用。

方法：采用微阵列杂交、TaqMan低密度阵列（TLDA）卡、qPCR和免疫组织化学（IHC）分析miRNAs、蛋白质和转录物的表达。

结果：在这里，我们已经证明，在ATH进展期间，人和小鼠主动脉组织中的常驻CD34阳性细胞增加，并且在人ATH主动脉的内膜和外膜中存在成簇的CD34阳性的细胞。我们引入与miR-125共享种子序列的miR-351作为CD34的潜在效应器。我们在小鼠第8外显子的内部/隐秘剪接位点显示剪接事件抄送34调控miRNAs（包括miR-125）对编码区或3'UTR的差异加入的基因（外显子开关）抄送34.

结论：我们引入了新的ATH进展的潜在介质（CD34细胞簇，miR-351），并提出了一种新的miRNA作用机制，该机制与靶基因中的一个隐秘剪接位点相连，可以调节miRNA对同源结合位点的差异加入。

关键词：CD34细胞簇；CD34隐性剪接；ORF miRNA靶点；动脉粥样硬化；外显子开关；miR-125b。

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数字

图1
ATH进展中小鼠miR-125a/miR-125b-1/miR-125b2基因簇的结构和表达。(A类)三个miRNA基因簇的图解。miRNA基因位置（相对位置）取自Ensembl基因组浏览器[36]。miR-125a的集合代码为ENSMUSG00000065479，miR-125b-1的集合代码是ENSMUSG100000093354，miR-125 b-2的集合代码则是ENSMusG00000065772。仅显示miRNA基因，没有显示其他编码/非编码基因。图形（基因组区域和基因框）不是按比例绘制的，每个簇的比例不同（参见染色体中绝对位置的编号）。右边的数字表示每个图形所覆盖的基因组序列的数量。(B类)miR-125a/miR-125b-1/miR-125b-2之间的同源性。图中显示了成熟miRNAs的序列。（！）代表同源核苷酸，而（.）代表删除的核苷酸。下划线为种子序列。(C类)小鼠miR-125a、miR-125b和U6-snRNA（作为标准化因子）在对照组、用对照SC-siRNA治疗的小鼠（24W，ATH进展）和用特异性抗CD40 siRNA治疗的鼠（siRNA治疗，24W）的基础样本（8W）中的绝对表达（无标准化）。所示为每个样本的Cts。表达数据是从原始Taqman低密度阵列卡（TLDA）实验中提取的[25]。

图2
人主动脉组织中CD34阳性细胞的检测。按照材料和方法中的描述，分离、切片、制备用于IHQ分析的整个人类动脉，并对CD34进行染色。(A类,B类)所示为两种不同新生内膜的代表性图像，抗CD34染色，不同放大倍数（3A为20×，3B为40×）。中的圆圈(A类)显示了一簇CD34阳性细胞，箭头在(B类)CD34染色显示±±个成纤维细胞阳性。组织用血-伊红染色。棒材为100μm。(C类)正常切片（非病变）的人体主动脉组织的代表性图像，显示内膜和肌肉层（垂直箭头），并进行抗CD34染色。组织用血卟啉-伊红进行复染。棒材为100μm。(D类)人类外膜抗CD34染色的代表性图像。中的圆圈(D类)显示CD34阳性细胞簇。组织用血卟啉-伊红进行复染。棒材为100μm。(E类)的表达式*CD34型*qPCR检测人类ATH斑块与正常腹主动脉的mRNA。(F类)的表达式*CD34型*与非CKD患者相比，CKD患者主动脉壁正常组织中的mRNA表达。

图2
人主动脉组织中CD34阳性细胞的检测。如材料和方法中所述，分离、切片、制备全人类动脉用于IHQ分析并对CD34进行染色。(A类,B类)所示为两种不同新生内膜的代表性图像，在不同放大倍数下（3A为20倍，3B为40倍）进行抗CD34染色。中的圆圈(A类)显示了一簇CD34阳性细胞，箭头在(B类)CD34染色显示±±个成纤维细胞阳性。组织用血-伊红染色。棒材为100μm。(C类)正常切片（非病变）的人体主动脉组织的代表性图像，显示内膜和肌肉层（垂直箭头），并进行抗CD34染色。组织用血卟啉-伊红进行复染。棒材为100μm。(D类)人类外膜抗CD34染色的代表性图像。中的圆圈(D类)显示CD34阳性细胞簇。组织用血卟啉-伊红进行复染。棒材为100μm。(E类)的表达式*CD34型*qPCR检测人类ATH斑块与正常腹主动脉的mRNA。(F类)的表达式*CD34型*与非CKD患者相比，CKD患者主动脉壁正常组织中的mRNA表达。

图3
检测小鼠主动脉血管周围组织中的CD34阳性细胞。按照材料和方法中的描述，分离、切片、制备ApoE-缺陷小鼠的主动脉，并对其进行CD34染色，将用打乱的（SC）siRNA处理24周作为对照，或用抗CD40特异性siRNA处理也处理24周。(A类,B类)显示SC-siRNA对照中单个CD34阳性细胞的代表性字段（箭头）(A类)或在抗CD40特异性siRNA中(B类). 组织用血-伊红染色。棒材为100μm。(C类)对接受上述治疗的ApoE缺陷小鼠的PVAT、主动脉内膜和外膜中CD34阳性细胞进行定量。两名不同的研究人员共检查了10个视野，结果表示为CD34阳性细胞占视野中嗜酸性粒细胞阳性细胞核总数的百分比。

图4
小鼠的结构和表达*抄送34*遗传位点及其与miR-125和其他miRNAs的相互作用。(A类)小鼠示意图*抄送34*基因。外显子由彩色方框表示，基因间区域由实线表示，剪接事件由点线表示。仅显示外显子6、7和8。前外显子X在此显示为外显子8的“a”部分（见正文）。图中还显示了外显子8处的两个终止密码子（TGA1、TGA2）以及内部/隐秘剪接位点(*I/CSS（英文）*)在外显子8a/b的虚拟接合处。编号指的是NCBI参考序列中的位置：NC_000067.6。按比例绘制（1cm=100bp）。(B类)显示这两者的图表*抄送34*转录物起源于外显子8的内部/隐秘剪接事件。编码区域用彩色方框表示，而3'UTR用白色条表示。还显示了两个终止密码子（大写的活性密码子）、内部/隐蔽剪接位点和靶向扫描小鼠在3’UTR预测的miRNA结合位点*抄送34*转录变体1。问号下显示了转录变体2编码区等效位置的结合位点。编号是指转录本的Genbank登录号。按比例绘制（1cm=100bp）。的信号群代码*抄送34*-TV1:ENSMUST00000110815。的信号群代码*抄送34*-TV2:ENSMUST00000016638。(C类)图中显示了CD34转录变体1和2（TV1、TV2）编码的两种不同蛋白质。图中显示了两种蛋白质亚型的糖基化N末端胞外域（Nt）、跨膜域（TM）和不同C末端域（Ct）。蛋白激酶C磷酸化位点标记在TV2中。编号是指成绩单的Genbank登录号（见B）。按比例绘制（1cm=100Aa）。PM代表质膜。

图5
的详细结构*抄送34*预测的miRNA结合位点所在的区域。(A类)3'端1 kb序列图*抄送34*图中显示了两个终止密码子（TGA1和TGA2）的位置、内部/隐秘剪接位点（I/CSS）和miRNA结合位点的位置。Expanded是70 bp的序列，它集中了miRNA结合位点。框中显示了miRNAs的种子序列以及miR-125和miR-351的比较。(B类)靶向miRNAs的表达*抄送34*在不同的实验条件下。将数据归一化为U6-snRNA后显示。从原始Taqman低密度阵列卡（TLDA）实验中提取的表达数据[25]。（*）只能分析一个样品。

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