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.2019年4月；33(4):5599-5614.
doi:10.1096/fj.201802063RR。 Epub 2019年1月22日。

MicroRNA-135a-3p通过靶向内皮细胞p38信号调节血管生成和组织修复

巴萨克·伊克利 1, 维诺娜·吴 1, Denizhan Ozdemir公司 1 2, 郝丽 1, 斯特凡·哈米格 1, 刘欣（Xin Liu） 1, 乔治·贾西迪斯 3, 亨利·S·程 1, 塞玛·纳兹利·阿维奇 1, 梅尔夫·科特 1, 又名 1, 拉斐尔·博埃希·吉马拉斯 4, 安德烈·马尼卡 4, 朱利奥·马奇尼 5, 斯坦·埃里克·瑞宁 6, 伊瓦尔·里斯内斯 6, 伊万娜·霍兰 1 7 8, 凯文·克罗斯 1, 丹尼斯·P·奥吉尔 3, 马克·范伯格 1
附属公司

MicroRNA-135a-3p通过靶向内皮细胞p38信号调节血管生成和组织修复

巴萨克·伊克利等。 美国财务会计准则委员会J. 2019年4月.

摘要

血管生成是组织损伤修复的关键过程，受促血管生成因子和抗血管生成因子之间的微妙平衡调节。在与血管生成受损相关的疾病状态中，我们发现miR-135a-3p可通过靶向内皮细胞（EC）p38信号在体内外快速诱导并作为抗血管生成microRNA（miRNA）。MiR-135a-3p过度表达显著抑制EC在基质凝胶中的增殖、迁移和网管形成，而MiR-135-3p中和则有相反的作用。利用转录组分析、生物信息学、3'-UTR报告子和miRNA核糖核蛋白复合物免疫沉淀分析以及小干扰RNA依赖性研究进行的机制研究表明，miR-135a-3p通过靶向亨廷顿相互作用蛋白1（HIP1）抑制内皮细胞中的p38信号通路。糖尿病db/db小鼠伤口局部注射miR-135a-3p抑制剂显著增加血管生成、肉芽组织厚度和伤口闭合率，而局部注射miR-135a-3p模拟物会削弱这些作用。最后，通过作为组织损伤模型的人类皮肤类器官的功能获得和丧失研究，我们证明miR-135a-3p通过靶向HIP1有效地调节p38信号和血管生成，以响应VEGF刺激。这些发现通过靶向VEGF-HIP1-p38K信号轴，确立了miR-135a-3p作为病理生理血管生成和组织修复的关键调节因子，为促进组织修复的血管生成治疗提供了新的靶点-Icli，B.，Wu，W.，Ozdemir，D.，Li，H.，Haemmig，S.，Liu，X.，Giatsidis，G.，Cheng，H.S.，Avci，S.N.，Kurt，M.，Lee，N.，Guimaraes，R.B.，Manica，A.，Marchini，J.F.，Ryning，S.E.，Risnes，I.，Hollan，I.、Croce，K.，Orgill，D.P.，Feinberg，M.W。MicroRNA-135a-3p通过靶向内皮细胞中的p38信号调节血管生成和组织修复。

关键词：血管内皮生长因子；糖尿病创面；人类类有机物。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者感谢Lay-Hong Ang（美国马萨诸塞州波士顿Beth Israel女执事医疗中心）的共焦显微镜技术援助，以及哈佛消化疾病中心和美国国立卫生研究院（NIH）国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所拨款P30DK034854这项工作得到了NIH国家心脏、肺和血液研究所拨款HL115141、HL117994和HL134849以及NIH国家普通医学研究所拨款GM115605（发给M.W.F.）的支持；Arthur K.Watson慈善信托基金（对M.W.F.）；Ralph博士和Marian Falk医学研究信托基金（美国银行，N.A.，受托人；M.W.F.）；美国心脏协会拨款18SFRN33900144（发给M.W.F.）；美国糖尿病协会拨款1-16-JDF-046（发给B.I.）；沃特金斯发现奖（授予B.I.）；勒纳青年调查员奖（授予B.I.）；杜比塔克博士前奖学金（发给D.O.）；以及东南部地区卫生局和挪威妇女公共卫生协会（给I.H.）的拨款。作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
MiR-135a-3p受促血管生成刺激物调节并抑制EC生长。A类)实时qPCR分析HUVEC中miR-135-3p表达对VEGF（25 ng/ml）和bFGF（25 ng/ml）的反应*P（P）与对照组（Ctrl）相比，P<0.01。B类)ACS患者血浆中循环miR-135a-3p水平升高(n个=20）与冠状动脉造影正常（NCA）的受试者相比(n个= 40). *P（P）与正常冠状动脉造影相比<0.05。C类)糖尿病患者皮肤中MiR-135a-3p表达增加(n个=13）与非糖尿病对照组相比(n个= 10). *P（P）与对照组相比<0.05。D类)野生型（WT）和db/db小鼠接受背部皮肤穿刺活检损伤，并在损伤后指定天收集伤口进行miR-135a-3p的qPCR分析。E类)转染NS的HUVEC米，miR-135a-3p米，miR抑制剂阴性对照（NS我)或miR-135a-3p抑制剂（miR-135a-3p我)进行BrdU细胞增殖试验。Ns，无显著性。所有数据代表平均值±扫描电镜. *P（P）与对照组相比<0.05。
图2
图2
MiR-135a-3p抑制内皮细胞的促血管生成功能在体外.转染NS的HUVEC米，miR-135a-3p米，miR抑制剂阴性对照（NS我)，或miR-135a-3p抑制剂（miR-135a-3p我)在matrigel中形成管状网络(A类); transwell Boyden腔中EC迁移(B类); 划痕试验(C类);n个=6/组。所有数据表示平均值±扫描电镜。比例尺：150µm(A类); 100微米(C类). *P（P）与NS相比<0.05**P（P）与NS相比<0.001。
图3
图3
生物信息学和miR-135a-3p基因分析预测p38为靶向信号通路。基因本体论和GSEA预测p38 MAPK信号通路是miR-135a-3p调控的顶级信号网络。
图4
图4
MiR-135a-3p调节内皮细胞下游P38信号的表达。转染NS的HUVEC米或miR-135a-3p米(A类)或miR抑制剂阴性对照（NS我)或miR-135a-3p抑制剂（miR-135a-3p我) (B类)，并在给定时间点用VEGF（50 ng/ml）刺激，使用p-p38、p38、p-ERK1/2、ERK1/2，p-Akt、Akt和β-肌动蛋白抗体进行Western分析(n个=3–5个实验）。Ns，无显著性。所有数据代表平均值±扫描电镜组间差异通过单因素方差分析进行分析*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.005, ***P（P）与对照组相比<0.001。
图5
图5
HIP1是一个真诚地EC中miR-135a-3p的靶点。A类)miR-135a-3p靶基因的发现和验证。转染NS的HUVEC米和miR-135a-3p米进行基因芯片分析。通过连续使用生物信息学和预测算法、实时qPCR、Western blot分析、3′-UTR报告研究和miRNP-IP分析，进一步缩小了潜在的基因靶点。B类,C类)NS转染的HUVECs米或miR-135a-3p米对HIP1表达进行实时qPCR(B类)或使用HIP1和GAPDH抗体进行Western blot分析(n个=3个实验）(C类).D类)在转染NS的HUVEC中定量HIP1 3′-UTR归一化为总蛋白的荧光素酶活性米或miR-135a-3p米(n个=3个实验）。E类)NS转染HUVECs中HIP1mRNA富集的MiRNP-IP分析米或miR-135a-3p米RT-qPCR检测HIP1或SMAD1*P（P）< 0.01. ns，无显著性。结果具有代表性n个=3个重复/组和2个独立实验。所有数据代表平均值±扫描电镜.
图6
图6
SiRNA-介导的HIP1敲除重述了内皮细胞中miR-135-3p的功能效应。A类,B类)用siRNA将HUVEC转染到HIP1或干扰对照（Ctrl）siRNA。蛋白质表达通过Western分析在基线条件下测定(A类)或对VEGF（50 ng/ml）治疗的反应(B类)使用HIP1、p-P38、P38和GAPDH抗体(n个=2个实验）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.001.C类–E类)用siRNA将HUVEC转染到HIP1或在NS存在下加扰Ctrl-siRNA米或miR-135a-3p米进行EC功能性血管生成分析以进行划痕分析(C类)、博伊登-transwell偏移(D类)或通过BrdU分析进行增殖(E类). *P（P）< 0.01.F类)将siRNA转染HUVEC至p38K或在NS存在下进行siRNA对照米或miR-135a-3p米进行EC划痕分析。Ns，无显著性。结果具有代表性n个=3个重复/组。所有数据代表平均值±扫描电镜组间差异通过单因素方差分析进行分析*P（P）< 0.01.
图7
图7
局部递送LNA-抗miR-135a-3p可促进db/db小鼠的伤口愈合。A类)在小鼠体内局部注射2次LNA-anti-miR-135a-3p（miR-135a-3di）或打乱的NS对照LNA-ati-miRs（NS）后我) (n个=11-12/组），小鼠背部皮肤损伤。B类–D类)伤口分析包括：伤口闭合区(B类)、GTT(C类)CD31共聚焦免疫荧光染色(D类).E类–G公司)在小鼠体内注射2次MiR-135a-3 PM或打乱的NS对照miRs（NS米) (n个=10/组），小鼠进行背部皮肤损伤。伤口分析包括：伤口闭合区(E类)、GTT(F类)共焦免疫荧光染色(G公司)对于CD31。所有数据代表平均值±扫描电镜.比例尺：5 mm(B类,E类); 500微米(C类,F类); 50微米(D类,G公司). *P（P）< 0.05.
图8
图8
抑制miR-135a-3p可促进人体皮肤类器官的血管生成。A类)将人类皮肤的Punch活检嵌入胶原基质中，转染miR抑制剂阴性对照（NS）我)，miR-135a-3p抑制剂（miR-135a-5p我)，NS米，或miR-135a-3p米，并培养指定的天数。B类,C类)用指示的miRNAs转导人皮肤类有机物，培养9天，然后用共焦免疫荧光染色检测CD31。D类,E类)人类皮肤有机物(n个=3–6）用指示的miRNAs转导并培养3 d。用VEGF（50 ng/ml）处理人类皮肤类器官，然后在指定时间进行p-p38、p38和β-actin的Western blot分析。所有数据代表平均值±扫描电镜.比例尺：50μm(B类); 25微米(C类). *P（P）<0.05（单因素方差分析）。
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