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.2019年3月1日;142(3):542-559.
doi:10.1093/brain/awy346。

PLPHP缺陷:临床、遗传、生化和机制方面的见解

德文·L·约翰斯通 1 2Hilal H Al-Shekaili公司  4Maja Tarailo-Graovac公司  4 5 6妮可·沃尔夫 7秋季S常春藤 8斯科特·德马雷斯特 9亚恩·罗塞尔 2乔利塔·恰帕特 10卡洛·范·勒蒙德 11克里斯汀·德克诺汉 1Ceres Kosuta公司 1 2凯文·班 1 2伊藤洋子 1Skye McBride公司 1哈立德·阿尔·蒂赫利 12拉娜·阿卜杜勒拉欣 13罗山库尔 14Amna Al Futaisi公司 14夏洛特·哈克斯玛 15希瑟·奥尔森 16劳菲Yr Sigurdardottir 17乔治安娜·阿诺德 18艾丽卡·H·杰克斯 19M Boon公司 20M Rebecca Heiner-Fokkema女士 21桑德拉·诺布尔 2马约莱因·博斯马 10朱迪思·詹斯 10 22大卫·A·库伦 23埃里克·扬·卡姆斯提格 24Britt Drögemöller博士 4 25科林·J·罗斯 4 25雅切克·马杰夫斯基 26 27梅根·T·乔 28琥珀·贝格特鲁普 28惠氏W沃瑟曼 4团拜 2伊莉丝·布林布尔 29萨拉·维奥兰特 30Sander M Houten公司 30罗恩·韦弗斯 22 31马蒂恩·范·法森 21Ido P Kema公司 21纳塔莉·利佩奇 1 Care4Care加拿大联合会 马修A行 1 32大卫·A·戴蒙 1 33罗纳德·J·A流浪者 11 22南达·弗霍文·杜伊夫 10 22马克·埃克尔 2Kym M抵制 1 33简·M·弗里德曼  4伊扎贝拉A佩纳 1 2克拉拉·D·M·凡·卡内贝克 4 22 34 35
附属公司

PLPHP缺陷:临床、遗传、生化和机制方面的见解

德文·L·约翰斯通等。 大脑. .

摘要

PLPBP中的双等位基因致病性变体(以前称为PROSC)最近被证明会导致一种新型的维生素B6依赖性癫痫,其病理生理学基础尚不清楚。如果不进行治疗,这种疾病可能发展为癫痫持续状态,并在婴儿期死亡。在这里,我们介绍了12例先前未描述的患者和6种PLPBP新的致病性变体。在确定PLPBP变异体之前,可疑的临床诊断包括线粒体脑病(两名患者)、叶酸反应性癫痫(一名患者)和与AADC缺乏症相关的运动障碍(一名病人)。PLPHP是一种编码蛋白,被认为对B6体内平衡至关重要。我们对变异体的致病性进行了建模,并开发了临床严重程度评分系统。最严重的表型与导致PLPBP功能丧失或显著影响蛋白质稳定性/PLP结合的变体有关。为了进一步探讨这种疾病的病理生理学,我们利用CRISPR/Cas9建立了第一个斑马鱼PLPHP缺乏模型。我们的模型概括了这种疾病,plpbp-/-幼虫在受精后10天表现出行为、生化和电生理学上的癫痫发作迹象,在受精后16天表现出早期死亡。吡哆醇治疗显著改善了plpbp-/-动物的癫痫表型和延长寿命。幼虫的氨基酸代谢以及GABA和儿茶酚胺的生物合成受到干扰,表明PLP依赖的酶活性受到损害。使用质谱法,我们观察到plpbp-/-斑马鱼、患者成纤维细胞和PLPHP-缺乏的HEK293细胞中的B6维生素水平发生了显著变化。对人类细胞和酵母的进一步研究提供了第一个经验证据,证明PLPHP定位于线粒体,并可能在线粒体代谢中发挥作用。这些模型为疾病机制提供了新的见解,并可作为药物发现的平台。

关键词:PLPBP;PROSC;癫痫;吡哆醇;维生素B6反应性癫痫。

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数字

图1
图1
轴向T2(前三列)和矢状(最后一列)T1-患者1、3和4的加权图像。3岁时,患者1的MRI正常。患者3和4显示简化的脑回模式,与前角相连的囊状结构和T2-齿状核门的高信号。白质信号为T2高强度并且看起来肿胀。与患者3相比,患者4(额外有脑室内血)的这些异常更为严重。胼胝体缺少最后面的部分。
图2
图2
迄今为止报道的致病性变体及其遗传位置,预测了PLPHP蛋白在PLP结合背景下的二级结构和3D结构。(A类)人类PLPBP公司基因结构、蛋白编码外显子以深蓝色显示,5′和3′UTR以浅蓝色显示。Darin之前报告的变体位置等。(2016)和Plecko等。(2017)显示为黑色,本研究确定的七个新变体显示为红色,之前报告但在我们队列中观察到的剪接变体显示为绿色。(B类)基于二级结构预测和三维模型的PLPHP蛋白质的二维图形表示(如D所示)。蓝色圆柱表示外部α螺旋,粉红色箭头表示组成(β/α)8-TIM桶结构的内部β链。在PLPHP缺乏症中观察到的突变残基以圆圈显示,黑色表示之前报告的变体,红色表示此处报告的新变体。位于建模PLP位置6°范围内的残留物以灰色显示。(C类)人类PLPHP模型的3D结构显示绿色的PLP分子,蓝色的赖氨酸47残基,以及根据A()根据a,预测的PLP-结合囊显示关键赖氨酸47(K47)作为PLP-Lys加合物(蓝色和绿色)、PLP-囊残基(<6º半径)以及在PLPHP缺乏症中发现的突变残基为黑色或红色。显示了Arpeggio计算的非价接触;黑色虚线表示疏水相互作用,橙色和红色虚线表示弱氢键和强氢键,灰色虚线表示碳磷相互作用,黄色虚线表示甲基硫磷相互作用。请注意,在患者1中,变异p.His275Asp与p.Thr116Ile纯合子共遗传,我们报告这是一个意义不明的变异。
图3
图3
有证据表明,在需要活跃线粒体代谢的几种能量源中,PLPHP在HeLa细胞中的线粒体富集以及PLPHP同源物在酵母中的生长缺陷。(A类)用免疫沉淀法纯化线粒体的野生型HeLa细胞和带有HA标记线粒体(HeLa HA-MITO)的HeLa电池进行Western blot,显示PLPHP在线粒体部分富集,其他抗体显示受到细胞质或其他细胞器的污染最小。(B类)野生型酵母细胞和突变菌株在富含油酸盐的培养基上的生长曲线。所示菌株为:野生型(WT,BY4742,蓝色),fox1Δ(绿色)和ybl036cΔ(紫色)。(C类)野生型和突变细胞在20 g/l葡萄糖和非发酵碳源(富油酸盐、2%乙醇和2%甘油培养基)上生长18小时后。数值表示为相对于野生型的增长百分比。所示菌株为:野生型(BY4742)(蓝色),fox1Δ(绿色)和ybl036cΔ(紫色)。()野生型细胞和突变细胞在2%乙醇培养基上的生长。所示菌株为:野生型(BY4742)(蓝色),ybl036cΔ+pPROSC1a(过氧化氢酶启动子下的人类PLPH)(橙色)或pPROSC2a(Tef启动子下人类PLPHP)(红色)和ybl036cΔ+空矢量(紫色)。
图4
图4
开发聚对苯二甲酸丁二醇酯−/−斑马鱼模型的CRISPR/Cas9和癫痫表型分析。(A类)斑马鱼幼虫野生型和纯合突变体基因型的色谱图聚对苯二甲酸丁二醇酯ot101/ot101和plpbpot102/ot102.复合杂合突变幼虫(聚对苯二甲酸丁二醇酯ot101/ot102)(未显示)用于与纯合子具有相同表型的大多数实验。(B类)裁剪的western blot(为了清楚起见)显示,在突变幼虫中未检测到Plphp蛋白。总蛋白(无染色印迹)如下所示用于标准化。补充材料中提供了完整的螺栓。(C类)存活曲线显示,与野生型和两种杂合子亲本型相比,突变幼虫的存活率降低(n个=每组20只幼虫)。(E类)突变幼虫在快速移动(>20 mm/s)时移动的总距离更大,在快速移动中花费的时间也更长(n个=每组16只幼虫)。(F类)相对mRNA表达增加c-fos公司与野生型幼虫相比,在突变幼虫中,戊四唑(PTZ)处理被用作阳性对照。(G公司)突变体的电生理记录示例(顶部)和野生型(底部)幼虫表现出更多类似发作的事件。插图是放大的影像式、间歇式和野生式录音示例(4 s)。意义:**P(P)<0.01, *P(P)<0.05.
图5
图5
维生素B6反应性癫痫聚对苯二甲酸丁二醇酯−/−斑马鱼幼虫。使用PLP可适度提高突变株的存活率(A类)但显示出更好的反应,这显然是吡哆醇的剂量依赖性(B类). (C类)对11 dpf斑马鱼幼虫的五分钟跟踪记录显示,突变体中的过度活动增加,而10 mM吡哆醇治疗可以缓解这种过度活动,测量方法如下()快速移动和(E类)快速移动的距离。(F类)盲人观察者确定的最高癫痫样行为类别。只有未经处理的突变幼虫表现出S2或S3癫痫样活性。(G公司)用5 mM吡哆醇处理突变体幼虫,使其电活动正常化。(H(H))未经处理和处理的突变幼虫的电生理记录示例。意义:**P(P)<0.01, *P(P)<0.05. PN=吡哆醇;WT=野生型。
图6
图6
靶向质谱研究聚对苯二甲酸丁二醇酯−/−斑马鱼幼虫表明B6维生素、氨基酸和神经递质的变化。(A类)突变型和野生型10 dpf幼虫的B6维生素谱。(B类)禁食24小时后,全幼虫突变型、杂合型和野生型11 dpf幼虫的氨基酸和神经递质谱。(C类)PLP合成和降解的代谢途径。()儿茶酚胺和微量胺的生物合成途径,强调(蓝色)AADC的作用。(E类)5-羟色胺生物合成途径,突显AADC的作用。3-MT=3-甲氧基吡喃胺;5-HIAA=5-羟基吲哚乙酸;5-HTTP=5-hydroxytpophan;AADC=芳香族--氨基酸脱羧酶;AO=醛氧化酶I;DH=β-NAD脱氢酶;PA=4-吡啶氧基酸;PK=吡哆醛激酶;PL=吡哆醛;PM=吡哆胺;PMP=5′-磷酸吡哆胺;PN=吡哆醇;PNPO=PNP氧化酶。意义:****P(P)<0.0001, ***P(P)<0.001, **P(P)<0.01, *P(P)<0.05.

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