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.2019年1月18日；11(2):328-349.
doi:10.18632/aging.101726。

低密度脂蛋白对低氧诱导的血管生成的损害涉及一个以HIF为中心的信号网络，该网络连接炎症性TNFα和血管生成性VEGF

金凤燕 1, 郑香玉 2, 杨延平 1, 刚瑶 三, 龙叶 4, 托尔斯滕·杜普纳 5, 德克·赫尔曼 6, 王海峰 7, 云代 4
附属公司

低密度脂蛋白对低氧诱导的血管生成的损害涉及一个以HIF为中心的信号网络，该网络连接炎症性TNFα和血管生成性VEGF

金凤燕等。 老龄化（纽约州奥尔巴尼市）. .

摘要

缺氧诱导因子（HIFs）通过上调各种促血管生成因子（尤其是VEGF）对缺氧的反应来介导血管生成。在这里，我们报道了缺氧意外地诱导内皮细胞（EC）产生大量促炎因子TNFα，这表明存在一个自分泌环，该自分泌环反过来通过NF-κB依赖过程激活HIF，从而产生VEGF，从而促进血管生成。相反，低密度脂蛋白（LDL）阻止缺氧或TNFα暴露的内皮细胞中HIF的表达，而HIF-1α或HIF-2α的敲除显著减弱内皮细胞低氧诱导的VEGF生成以及内皮细胞集落形成和管形成。值得注意的是，低密度脂蛋白通过下调TNF受体TNF-R1而非TNFα本身，以及规范和非规范NF-κB通路的多个关键成分，干扰TNFα/NF-κB/HIF/VEGF信号级联，从而减弱低氧诱导的血管生成。通过这样做，LDL能够抑制或下调HIF依赖性促血管生成下游的广泛靶点和信号。总之，这些发现表明内皮细胞中存在自我调节的TNFα/NF-κB/HIF/VEGF信号网络，至少在缺氧反应中，该网络可介导和微调血管生成。他们还表明，低密度脂蛋白通过破坏该网络而损害血管生成，这可能代表了低密度脂素抗血管生成特性的一种新机制。

关键词：血管生成；低氧诱导因子；低密度脂蛋白；核因子-kappaB；肿瘤坏死因子-α；血管内皮生长因子。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：所有作者均声明无利益冲突。

数字

图1
图1
GEP分析绘制了内皮细胞中HIF、TNFα、VEGF和NF-κB信号通路之间的潜在相关性。(A类,B类)通过使用R2:基因组学分析和可视化平台分析EC中涉及基因表达谱（GEP）的数据集，基于P（P）纵轴和横轴上显示的每对基因之间的相关性分析值（红色和蓝色分别表示正相关性和负相关性），单位(A类; 数据集，Exp HUVEC vs ESC-James-12-MAS5.0-u133p2）人干细胞（hESC）vs人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和(B类; 数据集，正常内皮细胞HUAEC/HUVEC-卢顿-38-MAS5.0-u133p2）HUVEC与人脐动脉内皮细胞（HUAEC）。热图中的数字表示每条路径的聚集区域（用虚线勾勒）。(C类,D类)基因本体（GO）分析用于分类(C类)HIF-1α-和(D类)HIF-2α相关基因根据其功能在所有类型的内皮细胞中，包括（数据集，正常内皮细胞HUAEC/HUVEC-卢顿-38-MAS5.0-u133p2）。
图2
图2
缺氧诱导内皮细胞的血管生成，与VEGF的产生和HIF的激活有关。(A类,B类)HUVEC在含有2%血清的ECGM培养基中培养，在缺氧（1%O2)或常氧（21%O2)条件，然后对细胞进行以下分析，包括(A类)菌落形成试验（72小时）和(B类)基于基质的试管形成分析（24小时）。显示了至少三个独立实验的代表性显微图像。箭头表示未闭合的血管结构环。(C类)当HUVEC在低氧（1%O2)或常氧（21%O2)条件下，按指定的时间间隔采集培养基，并进行ELISA检测，以确定VEGF的绝对量（pg/ml）。值表示至少三个独立实验的平均值±SD，一式三份*P（P）<0.05和**P（P）与对照组相比<0.01（21%O下72小时2); ns=不显著。(D类)HUVEC在低氧（1%O）下培养2)条件（左面板）或暴露于化学缺氧模拟乳酸（3 mM）达指定的时间间隔（6-24小时），然后进行Western blot分析以监测HIF-1α、HIF-2α和HIF-1β的表达。重制β−肌动蛋白印迹作为负荷控制。
图3
图3
敲除HIF-1α或HIF-2α均会损害缺氧诱导的内皮细胞血管生成和VEGF的生成。(A类)用pLKO.1构建物转染HUVEC，该构建物编码靶向HIF-1α和HIF-2α的shRNA，并将干扰序列作为阴性对照（shNC）。由于HUVEC中HIF-1α或HIF-2α的基础水平相对较低，这些转染细胞暴露于1%的O2（21%O224小时后进行Western blot分析，以确认shRNA分别敲除HIF-1α和HIF-2α。(B类,C类)然后将表达HIF-1α或HIF-2αshRNA的HUVEC暴露于1%的O2在指定的时间间隔内，然后进行菌落形成分析(B类，72小时）和基于Matrigel的试管形成分析(C类，24小时）。显示了至少三个独立实验的代表性显微镜图像。箭头表示未闭合的血管结构环。(D类)同时，在1%O下培养72小时后，通过ELISA测定VEGF水平2值表示至少三个独立实验的平均值±SD，一式三份**P（P）与shNC控制相比，<0.01。
图4
图4
天然低密度脂蛋白（而非oxLDL）抑制缺氧诱导的HIF和NF-κB信号的激活。HUVEC的处理如下：(A类)用低密度脂蛋白（100μg/ml）预处理48小时，然后在低氧（1%O）下培养2)额外48小时的条件；(B类)在有或无自由基清除剂PBN（2 mM）的情况下，用LDL（100μg/ml）预处理48小时，然后再暴露于PHD抑制剂DMOG（1μM）中72小时；(C类)用指示浓度的氧化低密度脂蛋白（oxLDL，μg/ml）预处理48小时，然后用DMOG（1μM）再处理72小时。治疗后，进行Western blot分析以监测HIF-1α、HIF-2α和HIF-1β的表达，以及NF-κB p65的磷酸化（S536）。(D类)或者，按照面板4B所述处理HUVEC，然后分离细胞质和细胞核部分，并进行Western blot分析，以监测HIF-1α、HIF-2α和HIF-1β的核移位。重制β-肌动蛋白和层粘连蛋白A的印迹，分别作为细胞质组分和核组分的负荷对照。(E类)HUVEC与NF-κB抑制剂PDTC（100μM）预先孵育4小时，然后再与DMOG（1μM）孵育72小时，之后通过Western blot分析监测HIF的蛋白水平。
图5
图5
缺氧诱导内皮细胞中TNFα自分泌，进而激活HIF和NF-κB产生VEGF。(A类)使用图1A和1B所述的相同方法，通过分析涉及TNFα刺激的HUVEC中基因表达谱（GEP）的数据集（数据集，Exp-HUVEC TNF-alpha-Kodama-25-MAS5.0-u133p2），生成热图。热图中的数字表示每条路径的聚集区域（用虚线勾勒）。(B类)HUVEC在低氧（1%O）下培养2)或常氧（21%O2)在图2C所述的条件下，进行ELISA检测，以确定在指定间隔收获的培养基中TNFα的绝对量（pg/ml）。值表示至少三个独立实验的平均值±SD，一式三份*P（P）<0.05和**P（P）与对照组相比<0.01（21%O下72小时2). (C类,D类)用低密度脂蛋白（100μg/ml）预处理HUVEC 48小时，然后用肿瘤坏死因子α（50 ng/ml）再间隔如下，然后进行Western blot分析以监测NF-κB p65的S536磷酸化（5分钟）和HIFs的表达(C类，4小时）和TNF-R1(D类，4小时）。使用ImageJ软件对TNF-R1的斑点进行密度定量。数值表明归一化为β-肌动蛋白后的折叠变化。(E类)在用IKK抑制剂Bay 11-7082（10μM）预处理4小时后，HUVEC再暴露于TNFα（50 ng/ml）24小时。然后进行实时PCR分析，以确定所示时间间隔内EC中VEGF的表达。值表示至少三个独立实验的平均值±SD，一式三份*P（P）与未处理对照组相比，<0.05；#P（P）与同一时间点单独TNFα相比，<0.05。
图6
图6
低密度脂蛋白通过下调其关键信号成分使TNFα诱导的NF-κB活化失活。(A类)如图2D所示，用3mM乳酸处理HUVECs，之后进行蛋白质印迹分析，以评估经典（例如TRAF2表达以及IKKα/β和p65磷酸化）和非经典（例如TRAF3和NIK表达）NF-κB途径的激活。(B类,C类)HUVECs用LDL（100μg/ml）预处理48小时，然后用TNFα（50 ng/ml）预处理48小时，间隔如下，之后进行Western印迹分析以监测IKKα/β的磷酸化（Ser176/180，5分钟）以及经典和非经典NF-κB途径的多个关键组分的表达，包括IKKα、IKKβ、Iκβα（5分钟）、p50（NF-κB1）、p52（NF-κB2）、p65（RelA）、RelB和c-Rel（4小时）。所有印迹均进行了密度定量，数值表明归一化为β-肌动蛋白后倍数增加。
图7
图7
低密度脂蛋白介导的低氧诱导血管生成障碍涉及广泛的HIF依赖信号通路。(A类)HUVEC暴露于指示浓度的LDL（25-100μg/ml）中48小时，然后在低氧（1%O）下培养2)额外48小时的条件(B类)将shRNA敲低HIF-1α或HIF-2α的HUVEC暴露于1%的O2（21%O2治疗后，进行Western blot分析以监测AKT（S473）、ERK1/2（T202/Y204）、CXCR4、VEGFR1和VEGFR2的磷酸化。重制β-肌动蛋白印迹作为负荷控制。(C类)缺氧通过TNFα自分泌环诱导血管生成并导致内皮细胞自我调节TNFα/NF-κB/HIF/VEGF信号网络激活的机制示意图，以及低密度脂蛋白（LDL）抗血管生成作用的潜在机制，a）LDL可能通过下调其受体TNF-R1而非TNFα本身来损害TNFα的自分泌环；和b）低密度脂蛋白通过下调规范和非规范NF-κb通路的多个关键成分，干扰TNFα-NF-κb-HIF-VEGF信号级联。
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