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.2019年1月17日；9(1):151.
doi:10.1038/s41598-018-36379-z。

神经元类蜡样脂褐质沉积症CLN5病亚型中自噬-溶酶体途径改变和α-同核蛋白上调

杰西·亚当斯 1 2, 梅丽莎·费尔伯恩 1 三, 约书亚·A·莫利纳 1, Alexa R Wilden公司 1, 巴比塔·阿迪卡里 1, 西奥多·布登 1 4, 斯特拉·Y·李 5
附属公司

神经元类蜡样脂褐质沉积症CLN5病亚型中自噬-溶酶体途径改变和α-同核蛋白上调

杰西·亚当斯等。 科学代表. .

摘要

神经蜡样脂褐质酶（NCL）是一组遗传性神经变性溶酶体储存障碍。CLN5缺乏导致NCL的一种亚型，称为CLN5疾病。CLN5是一种在细胞中功能不明确的可溶性溶酶体蛋白。据报道，在几种NCL亚型中，自噬标记蛋白LC3-II水平升高。在本报告中，我们研究了CLN5疾病中自噬是否发生改变。我们发现，在CLN5疾病患者成纤维细胞和CLN5缺乏的HeLa细胞中，LC3-II的基础水平均升高。用串联荧光mRFP-GFP-LC3进一步分析表明，自噬通量增加。我们发现在CLN5病患者成纤维细胞中α-synuclein（α-syn）基因SNCA高度上调。α-syn的聚集形式因其在帕金森病致病性中的作用而广为人知。较高的α-syn蛋白水平证实了患者细胞和CLN5敲低HeLa细胞中SNCA的上调。此外，α-syn定位于CLN5缺陷细胞溶酶体附近，表明其可能具有溶酶体相关功能。有趣的是，敲低SNCA可以逆转CLN5缺乏引起的溶酶体核周聚集。这些结果表明，α-syn可能影响非神经元细胞中的溶酶体聚集，类似于其在神经元突触前囊泡中的作用。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
CLN5缺乏的细胞自噬增强。(A类)用免疫印迹法分析两个健康对照成纤维细胞（C1和C2）和两个CLN5疾病患者成纤维细胞的总裂解物。显示了自噬标记物LC3-II和P62的基本水平。患者细胞中没有CLN5。(B类)用免疫印迹法分析WT和稳定的CLN5KD-HeLa细胞的总裂解物。CLN5 KD细胞中的CLN5显著减少。显示了自噬标记物LC3-II和P62的基本水平。(C类)用CQ、HBSS或HBSS处理WT和稳定的CLN5 KD-HeLa细胞 + CQ代表4 h.通过免疫印迹法分析样品。显示了用GAPDH归一化后LC3-II和P62的相对量。(天)WT和稳定的CLN5 KD HeLa细胞与HBSS孵育0，0.5，1，1.5 h.通过免疫印迹法分析样品。显示了用GAPDH归一化后LC3-II和P62的相对量。(E类)WT和稳定的CLN5 KD HeLa细胞与HBSS孵育0，2，4，8 h在环己酰亚胺和硼替佐米存在下。样品通过免疫印迹法进行分析。对于右侧的降解量化（N = 3） ，P62与每条车道的GAPDH信号进行了标准化。0 每个细胞系的h设为1。误差条代表SEM。β-肌动蛋白和GAPDH作为负荷控制进行了印迹。所有实验至少重复三次。
图2
图2
CLN5缺乏患者成纤维细胞中存在更多的自溶体。(A类)用mRFP-GFP-LC3质粒转染24小时的对照或CLN5缺陷成纤维细胞 时间是固定的。用共焦显微镜观察GFP和RFP信号。RFP/GFP信号重叠的部分使用ImageJ JACoP插件通过Mander系数进行分析。在ImageJ中，每个图像文件的两个通道首先被分割为两个单独的图像。然后将这两个图像用于插件JACoP分析。在执行JACoP-Mander系数之前，调整每个图像的阈值以减少背景信号。n个 = 15个单元格，误差条代表SEM(B类)对照转染mRFP-GFP-LC3质粒的成纤维细胞24 小时用CQ、baf-A或HBSS处理2小时 固定前h。使用ImageJ JACoP插件通过Mander系数分析RFP/GFP信号重叠的部分。n个 = 7个细胞，误差条代表SEM。所有实验至少重复三次。比例尺：20 微米。
图3
图3
在CLN5缺乏的细胞中检测到较高水平的α-syn。(A类)用免疫印迹法分析对照组和CLN5疾病患者成纤维细胞以及WT和CLN5KD-HeLa细胞的总裂解物。将GAPDH作为加载控制标记。(B类)对对照组和CLN5疾病患者成纤维细胞（顶部）以及WT和CLN5KD HeLa细胞（底部）进行α-syn免疫染色。使用ImageJ量化信号强度。从测量的每个细胞的总强度中减去背景，以获得正确的细胞总荧光。数据分析采用Student t检验，两个样本假设方差相等*P（P） < 0.0005，牛顿 = 成纤维细胞5个*P（P） < 0.0005，牛顿 = 20个细胞用于WT和CLN5 KD-HeLa细胞，误差条代表SEM。图像是使用共焦显微镜获得的。比例尺：20 微米。所有实验至少重复三次。
图4
图4
α-syn定位于溶酶体附近。(A类)固定CLN5 KD HeLa细胞，并对高尔基体标记物GRASP65（顶面）和溶酶体标记物Lamp1（底面）进行免疫染色。ImageJ JACoP插件用于分析同位化（皮尔逊系数）。在ImageJ中，每个图像文件的两个通道首先被分割为两个单独的图像。然后将这两个图像用于插件JACoP分析。分析每组中的5个图像（GRASP/α-syn组中的59个细胞；Lamp1/α-ssyn组中的42个细胞）。误差条代表SEM(B类)α-syn不定位于溶酶体腔。转染EGFP-Rab5 Q79L质粒24小时的CLN5 KD HeLa细胞 用HBSS孵育2小时 固定前h，对α-syn进行免疫染色。在对照组（−）中，细胞未经处理。固定细胞并进行CLN5免疫染色。使用共焦显微镜获取图像。比例尺：20 微米。(C类)α-合成物的亚细胞分馏。用CQ、HBSS或HBSS处理WT和稳定的CLN5 KD-HeLa细胞 + CQ代表2 h.分馏后，用免疫印迹法对样品进行分析。S、 可溶性；P、 颗粒。所有实验至少重复三次。
图5
图5
α-syn的敲除逆转了在CLN5 KD HeLa细胞中发现的核周溶酶体聚集表型。(A类)用对照或SNCA小干扰RNA（siRNA）转染HeLa或CLN5 KD细胞48 固定前小时。通过免疫染色lamp1观察溶酶体。比例尺：20 微米。(B类)免疫印迹显示CLN5 KD细胞中α-syn的表达被有效抑制。将GAPDH作为加载控制标记。(C类)在所示条件下量化溶酶体的细胞分布面积。在相位对比图像中，通过追踪细胞边界来标记细胞的轮廓。使用ImageJ“测量”功能测量细胞的总面积和细胞中带有lamp1信号的面积。进行单向方差分析，然后进行Tukey的事后检验*P < 0.05，无 = 25，误差条代表SEM(天)如图所示，对WT、稳定SNCA敲除细胞（SNCA KO）和稳定CLN5 KD的siRNA进行免疫印迹。β-actin作为负荷对照。所有实验至少重复三次。
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