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.2019年1月16日8:e40806。
doi:10.7554/eLife.40806。

异色基因沉默所需的局部H3K4去甲基化的卵巢缺失链接dLsd1到HP1a

附属公司

异色基因沉默所需的局部H3K4去甲基化的卵巢缺失链接dLsd1到HP1a

傅阳等。 埃利夫. .

摘要

异染色质蛋白1(HP1)是真核细胞中一种保守的染色体蛋白,在指导异染色素形成中起着重要作用,这一过程需要小RNA及其相关的精氨酸蛋白介导的共转录基因沉默。异染色质的形成需要清除活跃的表观遗传标记,如H3K4me2,但HP1和H3K4去甲基化之间的分子联系尚不清楚。在女性生育筛查中果蝇属,我们确定卵巢缺失(ova公司)在Piwi下游的干细胞生态位中发挥作用,支持生殖系干细胞分化。此外,ova公司作为位置效应杂色的抑制物,是沉默生殖系中的端粒转座子所必需的。在生物化学方面,Ova可将H3K4脱甲基酶dLsd1连接到HP1a,以进行局部组蛋白修饰。因此,我们的研究提供了HP1a介导的基因沉默过程中HP1a和局部H3K4去甲基化之间的分子联系,这是卵巢发育、转座子沉默和异染色质形成所必需的。

编辑注释:这篇文章经过了一个编辑过程,在这个过程中,作者决定如何回应同行评审中提出的问题。审查编辑的评估是,所有问题都已解决(见决定书)。

关键词:D.黑腹滨鹬;果蝇卵巢;HP1;异染色质;LSD1;卵巢缺失;再生医学;干细胞。

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利益冲突声明

FY、ZQ、HH、MH、XL、TC、RX未宣布竞争利益

数字

图1。
图1.卵巢是GSC和卵巢发育的生态位因子果蝇属.
()显示基因型苍蝇卵巢解剖的相位对比图像。比例尺,500μm。(b条)图表显示了指示雌性的总后代数量(分别为n=20、20、16、16、20)。(c(c))由α-Spectrin(红色)、Vasa(绿色)和DAPI(蓝色)标记的指定基因型的生殖道代表性图像。ova公司1/1ova公司1/4卵巢有许多球形的含光谱细胞(肿瘤细胞),或者没有生殖细胞(无菌细胞),这表明卵巢缺乏生殖细胞标记物Vasa(绿色)。野生型(WT)生殖道通常是位于前端的2个GSC。比例尺,10μm。()图表显示了所示基因型中正常、无菌和肿瘤生殖细胞的百分比(分别为14、20、30、117、57)。(e(电子))c587号ts秒>卵RNAi生殖菌在转移至29°C 7天和14天后积累GSC-like细胞。比例尺,10μm。((f))护卫细胞特异性表达ova公司挽救的卵子发生和GSC分化缺陷ova公司1/4女性。红色,α-光谱;绿色,瓦萨()定量所示基因型(n=25、20、30、117、57、30、21、31、23)生殖道中的GSC-like细胞数。(小时)由指定抗体或报告者染色的生殖道共聚焦切片。比例尺,10µm。(i) 所示基因型生殖细胞pMad和Dad-lacZ阳性细胞数量的定量结果。数值为平均值±SEM。;n>20。P(P)双尾学生的值-测试。
图1——图补充1。
图1——图补充1。椭圆形与CG5694同源。
()顶部,映射结果示意图ova公司1等位基因使用缺陷试剂盒。两个小缺陷,Df(2L)ED737和Df(2 L)BSC144,都未能补充ova公司1(图1——图补充1a)。最后,对这些缺陷重叠区域的分析牵涉到五个候选基因。灰色方框,ova公司基因组拯救片段。(b条)DNA测序显示CG5694编码区存在核仁缺失。(c(c))Ova示意图,果蝇属Ewg-PA和小鼠NRF-1 PA蛋白。黑盒,Nrf1 DNA结合域。灰盒,Nrf1激活物结合域。()Clustal Omega对Ova、Ewg和NRF-1的Nrf1结合域进行了多序列比对。 (e(电子))两个CG5694的示意图/ova公司等位基因,ova公司1、和ova公司4ova公司1是使用CRISPR-Cas9生成的缺失等位基因。
图1-图补充2。
图1-图补充2。卵巢不是细胞自主分化GSC所必需的。
(a–d)野生型和ova公司突变体GSCs。抗α-蛋白染色显示为红色。在克隆诱导(ACI)后4天或14天,对照克隆以缺乏lacZ(抗β-半乳糖苷酶,绿色)标记(a、 b条). The ova公司1ACI 4天或14天时的突变克隆(c、 d日). 比例尺,10μm。(e(电子))A类ova公司1用适当指定的卵母细胞进行生殖系克隆(抗球蛋白,红色)。比例尺,20μm。((f))野生型和野生型GSC维护率的时程分析ova公司突变体GSC克隆。()种系特异性敲除卵子(ova-GLKD)卵巢的相位对比图。比例尺,500μm。(小时)卵子GLKD germaria中GSC样细胞数量的定量。数值为平均值±SEM。;n=24。
图2。
图2卵巢在遗传上作用于琵琶的下游。
()显示基因型苍蝇卵巢解剖的相位对比图像。比例尺,500µm。(b条)图中显示了保留卵巢或挽救卵巢的生殖腺的百分比(分别为62、51、143、198)。(c(c))共聚焦截面鼠兔2/3卵形去角质的卵巢。箭头表示GSC样肿瘤;星号表示正在发育的生殖系囊肿。红色,α-光谱比例尺,10µm。()共聚焦截面鼠兔RNAipanx RNA干扰germaria。红色,α-Spectrin。比例尺,10µm。(e(电子))所示基因型生殖细胞中GSC-like细胞数量的量化。(n分别为55和43)。f、 所示基因型卵巢总RNA中TE水平的qPCR结果(归一化为actin5c)。数值为平均值±SEM。;n=3。P(P)双尾值-测试(*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001)。
图3。
图3卵巢与异染色质机制相互作用。
()Y2H测定卵巢和蛋白质之间的蛋白质相互作用,如图所示。(b–c类)蛋白质印迹显示卵巢和HP1a以及卵巢和dLsd1之间的co-IP相互作用。RFP-HP1a转基因由内源性启动子驱动。dLsd1-GFP转基因由一个普遍存在的启动子驱动。Flag-ova转基因由nos-GAL4驱动。()热图显示了检测到的前60个转座子的稳定状态mRNA水平(百万转/分)编号GAL4驱动ova-RNAi、EGFP-RNAi、,w个1118卵巢。显示了三个重复的平均值。最上调的转座子以粗体突出显示。(e(电子))对数相关散点图10转座子mRNA-seq在ova GLKD公司dLsd1 GLKD公司卵巢。R=0.9463,p<2.2×10−16皮尔逊相关系数。两种基因型中最上调的转座子以红点突出显示。
图3——图补充1。
图3补充了1。通过Y2H分析异染色质机械部件之间的蛋白质相互作用映射。
Y2H分析用于测试与Piwi/piRNAs复合物相关的蛋白质与异染色质机器中的蛋白质之间的相互作用。SD-WL,非选择性培养基;SD-WLH和SD-WLHA,选择性介质。Ф,空矢量。
图3——图补充2。
图3补充图2。卵巢作为位置效应杂色(PEV)的抑制物。
()照片显示了携带X染色体wm4h报告基因以及野生型和卵子杂合等位基因的成年女性的代表性眼睛色素。(b条)照片显示了携带第四染色体PEV报告者的成年女性的代表性眼睛色素,以及ova公司突变等位基因。(c(c))用分光光度计定量测量指定基因型的眼睛色素水平。数值为平均值±SEM。;n>5。P(P)双尾学生的值-测试。
图3——补充图3。
图3补充图3。piRNA的生物生成不需要Ova。
()散点图显示了蛋白质编码基因在w个1118ova GLKD公司卵巢。R采用皮尔逊相关系数。(b条)顶部,标准化小RNA长度剖面:来自具有指定基因型的卵巢的miRNAs(灰色列,插图)和piRNAs/siRNAs。重复衍生小RNA的底部、长度分布和丰度(蓝色,正;红色,反义)。(c(c))显示基因型卵巢的GFP-Piwi免疫染色。比例尺,10μm。()对照组和对照组卵巢mRNA水平的qPCR结果ova GLKD公司卵巢。数值为平均值±SEM。;n=4。P(P)双尾学生的价值-测试。(e(电子))热图显示单个转座子的重复小RNA水平(单位:百万转座子每分钟读取数)ova GLKD公司w个1118卵巢。((f))中TE mRNA水平的qPCR结果w个1118tjGAL4>ova RNAi(移至29°C持续7天)卵巢。***,双尾学生的p<0.001-测试。数值为平均值±SEM。;n=3。
图4。
图4.Ova作为连接dLsd1和HP1a的蛋白质适配器。
()Ova全长和截短形式的示意图。(b条)通过Y2H分析绘制HP1a和Ova之间的互惠结合区域。(c(c))通过Y2H分析绘制HP1a和dLsd1之间的互惠结合区域。()表明基因型苍蝇的卵巢。卵母细胞全长、ova250-486或HP1a::dLsd1特异性表达的护送ova公司1/4卵巢缺损。比例尺,500µm。(e(电子))代表性图像ova公司1/4通过HP1a::dLsd1的护送细胞特异性表达拯救的生殖细胞。红色,α-精蛋白;蓝色,DAPI。比例尺,10µm。((f))图中显示了指定雌性的后代总数(分别为11、23只)。()图表显示了所示基因型(归一化为actin5c)卵巢总RNA中TEs的折叠变化。数值为平均值±SEM。;n>4。P(P)双尾值-测试。
图4——图补充1。
图4图补充1..HP1a::dLsd1表达拯救ova公司丢失诱导的蛋白编码基因的去表达。
显示所示基因型卵巢mRNA-seq相对z评分的热图。中前39个上调基因ova公司图中显示了生殖系突变卵巢,并且通过HP1a::dLsd1拯救到野生型水平的基因在红色虚线框中突出显示。灰色阴影,不明显。
图5。
图5 Ova调节HP1a诱导的局部H3K4去甲基化。
()显示H3K4me2和Pol II ChIP-seq图谱的图表映射到对照组与卵子GLKD卵巢中的指示转座子位点。虚线框,转座子的增强子区域。RPM,读/百万。Bin,100个基点。(b条)5a(虚线框)中所示增强子区域中H3K4me2和Pol II密度的定量比较。P(P)双尾学生的值-测试。(c(c)),具有在种系细胞中表达普遍存在的lacO-GFP报告基因的指示基因型的卵巢。抗体染色显示GFP。比例尺,50µm。()显示GFP信号正常、减少或消失的指定基因型卵巢百分比的图表。(e(电子))所示基因型卵巢GFP mRNA的定量RT-PCR结果。数值为平均值±SEM。;n>4。P(P)双尾学生的值-测试。((f))显示标准化H3K4me2密度的图映射到所示基因型卵巢的lacO-GFP报告区。灰盒,lacO结合位点;紫色盒子,纳米促进剂。()显示标准化H3K4me2密度的图映射到所示基因型卵巢的lacO-terminator-GFP报告区。蓝色盒子,VASA终端。(小时)f或g中虚线框所示区域内H3K4me2密度的定量比较。P(P)双尾学生的值-测试。()lacO-GFP和lacO-terminator GFP报告卵巢GFP mRNA的定量RT-PCR结果。数值为平均值±SEM。;n=4。P(P)学生价值-测试。(j个)Ova功能的示意模型:在HP1a诱导的转录基因沉默期间,Ova作为一个蛋白适配器将HP1a与dLsd1连接起来,以实现局部H3K4去甲基化。
图5——图补充1。
图5补充图1:w1119和卵子GLKD卵巢中所有转座子的H3K4me2密度比较。
log10 H3K4me2 ChIP-seq读数的相关散点图w个1118ova GLKD公司卵巢。Het-A和TAHRE转座子以红点突出显示。
图5——图补充2。
图5数字补充2.将Ova与DNA或RNA结合不能诱导共转录基因沉默。
(),一幅描述使用lacI和lacO二进制系统进行DNA系链分析的动画。(b、 b'、c、c')显示基因型卵巢中GFP表达的共焦图像。绿色,抗GFP染色。红色,反犰狳。(),描述使用λN和boxB二进制系统进行RNA系链分析的卡通。(e、 e',f,f')显示基因型卵巢中GFP表达的共焦图像。比例尺,50μm。
作者回应图片1。
作者反应图1..dLsd1和HP1a在对照组和卵子GLKD生殖细胞中的表达和亚细胞定位
作者回复图片2。
作者响应图像2..qPCR检测对照组和ova公司GLKD卵巢。
作者回复图片3。
作者反应图3…H3K9me3在对照组和卵GLKD种苗中的表达。

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