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.2019年3月1日；129（3）：1372-1386。
doi:10.1172/JCI124508。 Epub 2019年2月18日。

血小板衍生miR-223促进动脉损伤修复中的表型转换

芷曾 1, 罗兴霞 1, 范雪娇 1, 艾利森·奥斯特里克 2, 帖木儿·亚罗文斯基 2, 苏美玲 1, 袁章 1, 彭向文 1, 一谢 2, 雷皮 三, 顾晓琼 4, Sookja金钟 5, 凯萨琳·A·马丁 2, 刘仁静（Renjing Liu） 6 7, 约翰·华 2, 外和堂 1
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血小板衍生miR-223促进动脉损伤修复中的表型转换

芷曾等。 临床研究杂志. .

摘要

动脉损伤后，内皮剥脱导致血小板活化和多种药物（如TXA2、PDGF）的传递，在损伤修复过程中促进VSMC去分化和增殖（内膜增生）。血管损伤修复的解决过程和过度修复的预防（将VSMC切换回不同的静止状态），目前尚不清楚。我们现在报道，VSMCs对AP的内化通过开启VSMC静止来促进动脉损伤的解决。使用谱系追踪报告小鼠（PF4-cre×mT/mG）进行的体内外研究表明，mTomato红色标记的VSMC（mT）在动脉丝损伤时摄取GFP标记的血小板（mG）。与AP共培养的VSMC的基因组miRNA测序发现血小板衍生miR-223显著增加。miR-223似乎直接靶向血管平滑肌细胞中的PDGFRβ，逆转损伤诱导的去分化。动脉损伤后，血小板miR-223-KO小鼠表现出内膜增生增加，而miR-223模拟减少内膜增生。miR-223表达降低的糖尿病小鼠表现出VSMC去分化和增殖增强，内膜增生增加。我们的结果表明，血小板衍生的miRNAs水平转移到VSMC为调节VSMC表型转换提供了一种新的机制。因此，血小板在血管损伤修复中发挥双重作用，启动即时修复过程，同时启动延迟过程以防止过度修复。

关键词：心血管疾病；血管生物学。

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数字

图1
图1。血小板被VSMC内化并诱导VSMC分化。
(A类)通过Western blot分析测定对照组VSMC（Ctrl）和与RP或AP共培养后VSMC中分化标记物（ACTA2、CNN1、TAGLN）和去分化标记物的表达（KLF4、KLF5、OPN）(n个= 4). 通过CCK8分析评估细胞增殖(n个= 7) (B类)和BrdU掺入分析(n个= 4) (C类). 数据表示为平均值±标准偏差*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001与Ctrl；#P（P）< 0.05,##P（P）< 0.01,###P（P）<0.001与RP。(D类)VSMC与CMFDA标记的血小板（绿色）在凝血酶存在下共培养1、2、4或24小时的代表性图像。VSMC用ACTA2（红色）染色，细胞核用DAPI显示(n个= 6). 比例尺：2.5μm。(E类)共焦的三维重建Z轴-与CMFDA标记的血小板共培养的整个VSMCs的堆叠图像（绿色）。(F类——我)与AP共培养的VSMC的透射电镜成像。面板提供血小板内化和并入VSMC的序列。红色箭头表示进入和内部化的血小板。低倍源电子显微照片如补充图3所示。比例尺：1μm。(J型)PF4-mT/mG和WT小鼠未损伤和损伤的股动脉切片的代表性图像(n个= 7). 箭头所示为多个含有绿色血小板的VSMC。伤后第7天采集股动脉。比例尺：20μm。使用单因素方差分析和Tukey-Kramer多重比较检验确定统计显著性(A类——C类).
图2
图2。AP将miR-143、miR-145和miR-223转移到VSMC，并促进VSMC分化。
(A类)与AP或不与AP共培养24小时的VSMC中前10个差异表达miRNAs的热图(n个= 3). (B类)miR-143、miR-145和miR-223在VSMC（Ctrl）和与AP共培养的VSMC中的表达(n个=4）。(C类)用前列环素或核糖核酸酶A预处理后与RP或AP共培养的VSMC（Ctrl）和VSMC中miR-143、miR-145和miR-223的表达(n个= 4). (D类)前列环素或核糖核酸酶A和凝血酶预处理后对照组VSMC（Ctrl）和与RP或AP共培养的VSMC中ACTA2和KLF4的表达(n个= 4). 数据表示为平均值±标准偏差*P（P）<0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001与Ctrl；†P（P）< 0.05,††P（P）与RP相比，<0.01；#P（P）< 0.05,##P（P）与AP相比<0.01。使用参数确定统计显著性t吨测试(B类)和单因素方差分析，然后进行Tukey-Kramer多重比较测试(C类和D类).
图3
图3。抑制VSMC脱分化需要加入血小板衍生的miRNAs。
(A类)在正常葡萄糖（NG；17.5 mM）或高糖（HG；35 mM）下0小时、24小时、1周或2周，来自MEG-01细胞的PLP中miR-143/145和miR-223的水平。数据以平均值±SD表示(n个= 6). **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001与NG(B类)PDGFRβ、KLF4和KLF5在与来自NG（NG PLP）或HG（HG PLP）的MEG-01细胞的PLP共培养的VSMC中的表达。数据以平均值±SD表示(n个= 6). ***P（P）<0.001与Ctrl；###P（P）<0.001 vs.NG PLP。(C类)PDGFRβ、KLF4和KLF5在与或不与来源于HG下的MEG-01细胞的PLP（HG-PLP）或用miR-143、miR-145和miR-223模拟物（miRNA-PLP）转染的HG-PLP共培养的VSMCs中的表达。数据以平均值±SD表示(n个= 6). **P（P）< 0.01, ***P（P）与HG PLP相比<0.001。(D类)VSMC与AP共培养3、6、12、24和48小时。分别用Western blot、BrdU掺入法和qPCR检测PDGFRβ表达（红线）、细胞增殖率（蓝线）和miR-223水平（黑线）。数据以平均值±SD表示(n个= 4). **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001 vs 3小时。使用单因素方差分析和Tukey-Kramer多重比较检验确定统计显著性(A类——D类).
图4
图4。miR-223调节股动脉损伤后体内Pdgfrβ表达和内膜增生。
(A类)钢丝损伤后4周，WT小鼠和miR-223 KO小鼠未损伤或损伤股动脉中Pdgfrβ的代表性免疫荧光(n个= 5). 绿色，Pdgfrβ；蓝色，DAPI核染色；红色，VSMC中的Acta2。比例尺：20μm。(B类)股动脉损伤后VSMC中Pdgfrβ表达的定量。数据以平均值±SD表示(n个= 5). ***P（P）<0.001 vs.WT；###P（P）与使用AgomiR-NC治疗的miR-223 KO小鼠相比，<0.001(C类)损伤后4周用AgomiR NC或AgomiR-223处理的WT小鼠和miR-223-KO小鼠的股动脉序列横截面的H&E染色(n个= 5). 比例尺：100μm。(D类)损伤股动脉切片I/M比值的形态测量。数据表示为I/M比率的平均值±SD(n个= 5). **P（P）与WT相比<0.01；##P（P）与使用AgomiR-NC治疗的miR-223 KO小鼠相比，差异<0.01。使用单向方差分析和Tukey-Kramer多重比较试验确定统计显著性(B类和D类).
图5
图5。DM血小板和受损股动脉中VSMC的miR-223水平降低。
(A类)miR-223在健康人血小板中的表达（HS，n个=8）和糖尿病患者（DM，n个= 13); 和非糖尿病小鼠（非糖尿病，n个=10）和STZ-DM小鼠(n个= 11). 数据以中位数和IQR表示*P（P）与HS或非DM相比<0.05(B类)PF4-cre:mT/mG STZ-DM小鼠未损伤和损伤股动脉切片的代表性图像(n个= 7). 箭头表示VSMC合并血小板。伤后第7天采集股动脉。比例尺：20μm。(C类)非DM或STZ-DM条件下PF4-cre:mT/mG小鼠股动脉损伤后miR-223表达的代表性图像(n个= 5). 伤后第7天采集股动脉。红色，Acta2；绿色，mGFP；白色，DAPI。比例尺：20μm。(D类)损伤股动脉mGFP阳性血管平滑肌细胞miR-223表达的定量研究(n个= 5). 数据表示为平均值±标准偏差*P（P）<0.05 vs.非糖尿病。使用Mann-Whitney确定统计显著性U型测试(A类)和参数t吨测试(D类).
图6
图6。血小板衍生miR-223可抑制糖尿病小鼠股动脉钢丝损伤后新生内膜的形成。
(A类)非糖尿病或STZ-DM条件下PF4-cre:mT/mG小鼠未损伤和损伤股动脉Pdgfrβ表达的代表性图像(n个= 5). 伤后第7天采集股动脉。比例尺：20μm。(B类)损伤股动脉mGFP阳性血管平滑肌细胞Pdgfrβ表达的定量研究(n个= 5). 数据以平均值±标准差表示*P（P）与非糖尿病患者相比，<0.05(C类)非糖尿病小鼠和STZ-DM小鼠股动脉损伤后4周AgomiR-NC或AgomiR223治疗后未损伤或损伤的股动脉中Pdgfrβ的代表性免疫荧光(n个= 5). 绿色，Pdgfrβ；蓝色，DAPI，反映细胞总数；红色，VSMC中的Acta2。比例尺：20μm。(D类)股动脉损伤后血管平滑肌细胞Pdgfrβ表达的定量研究(n个= 5). 数据表示为平均值±标准偏差**P（P）与非糖尿病患者相比<0.01；###P（P）与服用AgomiR-NC的STZ-DM小鼠相比，<0.001(E类)非糖尿病小鼠和STZ-DM小鼠伤后4周AgomiR-NC或AgomiR223处理后股动脉连续横截面的H&E染色(n个= 5). 比例尺：100μm。(F类)损伤股动脉切片I/M比值的形态测量(n个= 5). 数据表示为I/M比率的平均值±SD***P（P）与非糖尿病患者相比，<0.001；#P（P）与经AgomiR-NC治疗的STZ-DM小鼠相比，<0.05。使用参数确定统计显著性t吨测试(B类)和单因素方差分析，然后进行Tukey-Kramer多重比较测试(D类和F类).
图7
图7。提出了正常血小板和DM血小板中miRNAs转移到受损血管中VSMC的模型。
在没有血管损伤的情况下，内皮屏障（ENDO）是完整的，血小板是静止的。随着损伤（如血管成形术），内皮屏障受损。血小板（PLT）被激活，（i）释放剂促进VSMC去分化；和（ii）被VSMC吸收并释放miR-223，对VSMC施加制动，防止过度VSMC修复，减少内膜增生。DM血小板降低了miR-223，导致损伤后VSMC过度增殖。插图显示miR-223的生化靶点，包括PDGFRβ。DM血小板中miR-223水平显著降低，导致PDGFRβ上调，促进异常VSMC脱分化、增殖和内膜增生。
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