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.2019年1月8日；8(1):1-15.
doi:10.1089/biores.2018.0039。 2019年eCollection。

利用无支架血管前内皮细胞构建血管组织工程

Sanket Pattanaik公司 1, 蔡斯·阿尔布拉 1, 希瑟·班布里奇 1, 莎拉·格雷斯·丹尼斯 1, 斯蒂芬·范恩 1, 迈克尔·J·约斯特 1
附属公司

利用无支架血管前内皮细胞构建血管组织工程

Sanket Pattanaik公司等。 Biores开放访问. .

摘要

血管化仍然是工程组织生存能力的主要限制因素。通过比较体内自组装血管内皮-成纤维细胞模型对无血管移植物的血管化动力学，我们探讨了植入物早期血管化速度的限制，在此期间组织缺氧开始影响细胞存活。无支架的普遍内皮-成纤维细胞构建物（SPECs）可作为替代组织中的模块化可重塑血管床。在54只Sprague-Dawley大鼠中植入SPEC、仅成纤维细胞球体（FOS）和硅胶植入物，并在6、12和24小时收获(n个=每个时间点和植入物类型5个）。我们假设，与FOS和硅胶植入物相比，SPEC的主要内皮网络允许在24小时内更早的吻合，并增加植入物内部的血管形成。植入后6小时，所有结构均被内皮衬里包裹，此时SPEC内线与宿主血管网融合。与其他结构相比，SPECs在6-12小时时具有明显更高的微血管面积分数和穿透索的分支/连接密度。此外，SPEC显示血管周围细胞募集、管腔形成和网络重构与12-24小时血管成熟一致；然而，这些植入物在我们的观察窗内灌注不良，表明腔内通畅性较差。FOS血管特征（微血管面积和穿透索密度）在12-24小时内增加，以代表SPEC植入物的特征，这表明与普通移植相比，宿主对无血管移植的反应潜伏期为12小时。了解这一时间优势在体外流行网络自组装以及对SPEC植入目前局限性的理解建立在我们组织移植血管化的理论时间模型之上，并提出了一个关键的时间窗口，在此期间，技术改进和血管治疗可以提高工程组织的存活率。

关键词：血管生成；血管；共培养模式；内皮细胞；体内血管化；流行；无支架组织工程。

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不存在相互竞争的财务利益。

数字

<b>图1</b>
图1。
TEC血管化的时间模型。模型解释了与（1）内皮细胞激活、（2）内皮细胞迁移和植入物基质重塑、（3）原始网络形成、（4）宿主/植入物内皮结构吻合、（5）网络重塑、（6）内皮结构内腔形成和（7）相关的发展时间通过壁细胞募集使血管成熟。这导致在植入物中形成血液灌注的血管蒂。描述了不同植入物类型的预期切入点，之前的发展可能发生在体外或由捐赠者提供。TEC，组织工程构建。
<b>图2</b>
图2。
（a–c）从2%琼脂糖霉菌中分离出来的杆状SPEC全贴免疫荧光图像。用Phalloidin 488（绿色）标记的成纤维细胞中的F-actin纤维代表植入物的基质成分，CD31标记的结构（红色）代表内皮细胞的毛细血管样索。（d，e）杆状FOS的全套免疫荧光图像类似地在用Phalloidin 488标记的成纤维细胞中呈现F-肌动蛋白纤维（绿色）。然而，这些结构缺乏CD31标记的结构（红色）（f）苏木精和伊红染色大鼠后肢组织切片的光学显微镜图像（10 μm）包含股外侧肌和股二头肌之间植入SPEC（环绕）的横截面。FOS，纯成纤维细胞球体；SPEC，无支架内皮细胞-成纤维细胞构建物。
<b>图3</b>
图3。
SPEC和FOS中血管标记物VEGFR2、VE-cadherin、vWF和DLL4的Western blot在体外组件。GAPDH内务蛋白起负荷控制作用。在SPEC和FOS生长的第1天、第2天和第3天追踪与内皮尖端细胞表型相对应的抗-Dll4印迹。通过归一化FOS第3天对照，计算相对光密度。显示DLL4相对光密度与GAPDH相对光密度的比值(n个 = 3). VE-cadherin western blot同样反映了Dll4在D2的峰值和在D3的降低。这表明SPEC孵育2天后有一段静止期。内皮细胞的标志物VEGFR2和vWF在D2达到峰值后保持稳定，这表明在D3内皮细胞增殖有限。ns，无统计学意义。
<b>图4</b>
图4。
（a）通过Hoechst核染色（Cyan）和内皮细胞抗CD31抗体染色（Red）的免疫荧光成像，对TEC内的内皮细胞重组进行成像。6岁时，两种结构类型周围都有一层内皮细胞囊样层 h.SPEC中的内部内皮结构与该囊交叉，形成花边层索。到12点 h、 内皮索的结合带穿透SPEC内部，而成纤维细胞球体仍然缺乏内部内皮结构。24点 h、 成纤维细胞球体和SPEC都被内皮索侵入，其中SPEC在植入物/肌肉界面处包含更复杂的分支结构。（b）CD31型+植入的SPEC细胞内可见明显管腔的结构（红色），12岁时标记有细胞跟踪器（蓝色） 植入后h。（c）来自内皮囊的侵入性血管性血友病因子+内皮分支与细胞跟踪器阳性内皮索（洋红）吻合，表明宿主和植入物对SPEC血管网络的贡献。
<b>图5：</b>
图5：。
含有硅胶植入物横截面的组织切片的免疫荧光图像（10 μm）用Hoechst核染色（青色）和内皮细胞CD31抗体染色（红色）标记。切片显示植入物周围存在富内皮细胞囊（红色），但在6和24岁时没有任何结构或细胞渗透植入物本身 植入后h。
<b>图6</b>
图6。
（a–c）单克隆抗人CD31抗体染色（红色）和多克隆抗vWF抗体染色（绿色）共同定位于植入衍生的人类内皮结构（黄色）。这些结构仅限于植入SPEC的6和24的内部组件 h.宿主衍生的血管网仅对抗vWF染色，在SPEC周围的外囊和相对宿主后肢肌肉中植入部位远端的血管中可见。
<b>图7</b>
图7。
植入结构的免疫荧光图像与vWF的比较+血管（右侧；红色）和αSMA+姊妹节（10）上的细胞（左侧；黄色） 间隔μm）。（a）座椅模块组件+6时的表达式 植入后h与血管发育不一致，小管相关的SMA很少+细胞。（b）12点 植入后h，姐妹切片显示存在αSMA+显示vWF的区域中的单元格+有明显管腔的血管。这与招募αSMA一致+血管成熟过程中需要周细胞或血管壁细胞。
<b>图8</b>
图8。
（a）植入血管结构（CD31或vWF+)基于组织横截面（10µm深）的免疫荧光图像进行分割，其中包含整个种植体横截面以及完整的肌肉/种植体界面。与该界面直接相连的内皮结构和植入物周围的内皮囊与植入物内部的血管结构（黄色）分开（绿色）。（b）计算每个植入物的总微血管面积分数，或包含血管成分的植入物横截面积百分比，并在6、12和24小时的时间点比较植入物类型。（c）计算每个植入物在肌肉/植入物界面处不包括内皮囊的微血管面积分数。（d）穿透植入物内部的内皮索的分数是通过将发现的索长度（不包括胶囊血管）除以血管网络的总长度来计算的。该分数是宿主内每个植入物内部和周围血管侵袭性的替代标记。（e，f）结合密度计算为每µm发现的血管分支点数量2种植体横截面积。同样，分支密度计算为每µm的分支数2这两个指标评估了每种植入物类型中发育中的血管网络随时间的分支复杂性。SPECs的微血管面积、连接密度和分支密度在所有时间点均显著高于其他植入物。成纤维细胞球体在12到24小时之间的微血管面积和穿透小管分数增长最快，24小时的分支密度与SPECs相似(第页 < 0.05）种植体类型和SPEC之间**统计显著差异(第页 < 0.001）。
<b>图8</b>
图8。
（a）植入血管结构（CD31或vWF+)基于组织横截面（10µm深）的免疫荧光图像进行分割，其中包含整个种植体横截面以及完整的肌肉/种植体界面。与该界面直接相连的内皮结构和植入物周围的内皮囊与植入物内部的血管结构（黄色）分开（绿色）。（b）计算每个植入物的总微血管面积分数，或包含血管成分的植入物横截面积百分比，并在6、12和24小时的时间点比较植入物类型。（c）计算每个植入物在肌肉/植入物界面处不包括内皮囊的微血管面积分数。（d）穿透植入物内部的内皮索的分数是通过将发现的索长度（不包括胶囊血管）除以血管网络的总长度来计算的。该分数是宿主内每个植入物内部和周围血管侵袭性的替代标记。（e，f）结合密度计算为每µm发现的血管分支点数量2植入物横截面积的百分比。同样，分支密度计算为每µm的分支数2这两个指标评估了不同植入物类型的血管网络分支的复杂性。SPECs的微血管面积、连接密度和分支密度在所有时间点均显著高于其他植入物。成纤维细胞球体在12到24小时之间的微血管面积和穿透小管分数增长最快，24小时的分支密度与SPECs相似(第页 < 0.05）种植体类型和SPEC之间**统计显著差异(第页 < 0.001）。
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