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.2019年3月8日；294(10):3744-3759.
doi:10.1074/jbc。RA118.004825。 Epub 2019年1月11日。

来自超氧化物歧化酶1（SOD1）的CNS衍生细胞外囊泡G93A公司ALS小鼠来源于星形胶质细胞和神经元，携带错误折叠的SOD1

朱迪思·西尔弗曼 1, 达伦·克里斯蒂 1, Chih Cheih Shyu先生 1, Kyung-Mee Moon（京美文） 2, 萨拉·费尔南多 1, 佐伊·吉登 1, 凯瑟琳·考恩 1, 潘玉欣 1, R格雷格·斯泰西 2, 莱斯利一世（Leslie I Grad） 1, 卢克·麦克拉里 1 三, 伊恩·麦肯齐 4, 伦纳德·J·福斯特 2, 尼尔·R·现金男 5
附属机构

来自超氧化物歧化酶1（SOD1）的CNS衍生细胞外囊泡G93A公司ALS小鼠来源于星形胶质细胞和神经元，携带错误折叠的SOD1

朱迪思·西尔弗曼等。 生物化学杂志. .

摘要

细胞外小泡（EV）由培养物中的无数细胞和单细胞生物体分泌，它们在哺乳动物体液中的鉴定表明EV释放也发生在生物体水平。然而，尽管更好地理解EV在生物体中的作用显然很重要，但固体组织中的EV却很少受到关注。在这里，我们修改了从原代神经细胞培养物中分离EV的方案，通过连续离心和蔗糖梯度纯化从冷冻的小鼠和人类神经组织中收集EV。定量蛋白质组学比较来自非转基因（NTg）和转基因肌萎缩侧索硬化（ALS）小鼠模型超氧化物歧化酶1（SOD1）的脑源EVG93A公司发现这些EV含有典型的外体标记，并富含突触和RNA结合蛋白。编译的脑EV蛋白质组包含许多与ALS有关的蛋白质，以及SOD1中的EVG93A公司与NTg动物相比，小鼠的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白明显减少。我们观察到来自NTg和SOD1的脑和脊髓源性EVG93A公司小鼠的星形胶质细胞标记GLAST和突触标记SNAP25呈阳性，而小胶质细胞标记CD11b基本上不存在。SOD1脑和脊髓的EVG93A公司ALS小鼠模型以及人类SOD1家族性ALS患者脊髓中含有大量错误折叠和非天然二硫键交联聚集的SOD1。我们的研究结果表明，来自ALS动物模型的中枢神经系统衍生的EV含有致病性致病蛋白，并表明大脑星形胶质细胞和神经元，而不是小胶质细胞，是主要的EV来源。

关键词：肌萎缩侧索硬化症（ALS）；星形胶质细胞；中枢神经系统；外泌体（囊泡）；细胞外小泡；神经变性；蛋白质稳态；蛋白质组学；分泌。

PubMed免责声明

利益冲突声明

N.R.C.是ProMIS Neurosciences的首席科学官，该公司已授权使用3H1错误折叠的SOD1特异性抗体技术

数字

图1。
图1。
完整的EV是从整个小鼠大脑的细胞外间隙中分离出来的，污染最小。 A类，收集NTg动物全脑EV，10万×克颗粒通过逐步蔗糖梯度漂浮（分数1=0%，分数6=60%蔗糖）。B类，将NTg纯化的BDEV与用棒式均质器制备的等量且不断增加的NTg脑匀浆直接进行比较。GRP78、PrP和SOD1暴露30秒；Bcl-2和GM130暴露300秒。C类，BDEV的电子显微照片（100000×克颗粒）来自NTg–和人类SOD1G93A公司–过度表达的动物显示具有典型外显体形态的囊泡结构。比例尺，100纳米。D类，BDEV 100000×克在11步碘克沙醇梯度中对颗粒进行分级（分数1=0%，分数11=60%）。E类纯化组织衍生MV的电子显微照片，在15000×克和EX在100000×g.大脑MV比例尺=200纳米。大脑EX,脊髓MV和前任、和大脑和脊髓MV嵌入比例尺，100纳米。
图2。
图2。
BDEX和表面蛋白质组的定量鉴定。 A–D，使用Perseus（89，90）分析定量蛋白质组学数据。数据在x个轴和的负对数第页上的值年轴。对于每个图，蛋白质用不同的颜色和形状根据任一样品中富集的重要性。粉红色方块，显著第页对错误发现率应用Benjamin–Hochberg修正后的值；蓝色三角形，与错误发现更正无关，但具有第页值<0.01；绿色钻石,第页值介于0.01和1之间。选择的蛋白质被标记。列出了大量丰富的KEGG术语在下面图表。A类，SOD1G93A公司BDEX超过NTg BDEX。B类，SOD1表面蛋白G93A公司NTg BDEX表面蛋白上的BDEX。C类、地表相对丰度比与整个囊泡，所有蛋白质都来自NTg样本。D类，SOD1的相对丰度比G93A公司囊泡表面蛋白与NTg整个囊泡。E类，表面缺失BDEX蛋白质组和表面蛋白质组之间重叠的维恩图。F类维恩图显示了小鼠BDEX与人脑脊液中发现的囊泡（49）和人SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系分泌的囊泡之间的重叠（50）。
图3。
图3。
BDEX和表面蛋白质组显著丰富了反映其神经元和囊泡起源的基因本体注释。与整个小鼠基因组相比，使用ErmineJ（91，92）对BDEX蛋白质组或BDEX表面蛋白质组中的GO注释进行了富集。错误发现率校正用于确定显著富集。A类，BDEX和表面蛋白质组之间GO注释重叠的维恩图。B类，显示了一组代表性明显过高的GO术语；完整列表可以在中找到表S8和S9.
图4。
图4。
流式细胞术分析表明，大多数BDMV可能来源于星形胶质细胞。 A类在1%Nonidet P-40中裂解前后BDEX和MV的正向散射图显示囊泡信号与噪声的分离。显示任意门内总事件的百分比仅供说明。B类和C类星形胶质细胞标记物（GLAST）、神经元标记物NCAM（CD56）、胞外体标记物（CD81）、突触囊泡标记物（SNAP25）和小胶质细胞标记（CD11b）的总事件（包括噪声）阳性百分比。减去分析后发现的阳性事件数。数据通过双向方差分析进行分析。G93A和NTg BDMV之间没有差异(B类,第页=0.4012）或BDEX(C类,第页=0.8095）发现标记表达。显示了在溶解样品中减去阳性事件后所收集的所有事件的阳性百分比。数据来自4-5个相同的实验。D类与NTg脑MV相比，大多数标记物的NTg脑EX阳性事件百分比显著降低。采用Sidak多重比较试验，通过双向方差分析对数据进行分析：第页=0.0002（相互作用），第页<0.0001（标记），以及第页<0.0001（囊泡）。E类和F类脊髓囊泡中溶解减法后总事件（包括噪声）的阳性百分比。数据通过双向方差分析进行分析。G93A和NTg脊髓MV无差异(E类,第页=0.6218）和EX(F类,第页=0.4530）发现标记表达。G公司，当通过双向方差分析直接将脊髓MV与EX进行比较时，第页=0.0007（相互作用），第页<0.0001（标记），以及第页=0.0321（囊泡）。Sidak的多重比较试验表明，个体标记之间存在一些显著差异。H（H）和我，正MV百分比的比较(H（H）)和EX(我)大脑和脊髓之间的事件(Sp.跳线). 使用Sidak的多重比较检验对数据进行双向方差分析：MV(H（H）),第页=0.0001（相互作用），第页<0.0001（标记），以及第页<0.0001（组织）；对于EX(我),第页<0.0001（相互作用），第页<0.0001（标记），以及第页=0.7523（组织）。误差线、瑞典。
图5。
图5。
小鼠脑EV反映了随着时间的推移发生的神经退化。2个月龄和5个月龄小鼠的脑微泡(农业部)用GLAST抗体进行检测(A类)，CD11b(B类)，CD56(C类)和CD81(D类)流式细胞术检测阳性囊泡数。阳性事件报告为总阳性人群（包括噪声）的百分比减去囊泡溶解后阳性事件的百分比。数据通过双向方差分析和Sidak多重比较检验分析基因型和年龄的影响：Glast(A类),第页=0.0007（相互作用），第页=0.0511（年龄），以及第页=0.0206（基因型）；CD11b型(B类),第页=0.3539（相互作用），第页=0.0001（年龄），以及第页=0.03779（基因型）。C类和D类，结果不显著。误差线、瑞典。
图6。
图6。
过度表达人SOD1的小鼠脑和脊髓EVG93A公司包含并用错误折叠的SOD1装饰。 A类，完整的EX免疫沉淀，带有错误折叠的SOD1特异性抗体3H1和10C12（3，53）。B类和C类，来自三个免疫沉淀实验的信号定量：大脑(B类)，学生的t吨测试，第页=0.0447（3H1）和第页=0.0170（10C12）；脊髓(C类)，学生的t吨测试，第页=0.0070（3H1）和第页=0.0159（10C12）。D类，从100000×克颗粒（EX）和15000×克在化学发光ELISA中，对大脑和脊髓中的颗粒（MV）进行错误折叠SOD1的检测。抗misfolded SOD1抗体3H1作为捕获抗体。数据作为原始发光单位提供(RLU（RLU）)，因为没有可用于比较的错误折叠SOD1标准。数据由配对学生的t吨测试。E类，来自人类脊髓组织的完整EX，对照组和SOD1 FALS各四个(n个=3 SOD1-A4V，n个=1 SOD1-N139K），用错误折叠的SOD1特异性抗体3H1和10C12进行免疫沉淀（3，53）。显示了来自四个免疫沉淀实验的信号定量，并将其归一化为源组织的重量。差异由Kruskal–Wallis非参数方差分析确定(第页=0.0009）采用邓恩多重比较试验(第页3H1=0.0496，第页=0.0219（对于10C12）。F类、纯化的人脊髓MV裂解物、三个对照组和两个SOD1A4V型通过ELISA检测FALS组织中错误折叠的SOD1。抗misfolded SOD1抗体3H1作为捕获抗体。数据由Student’s分析t吨测试(第页= 0.1003).知识产权免疫沉淀；IB公司免疫印迹；误差线、瑞典。
图7。
图7。
小鼠和人脑EV中突变SOD1的差异聚集特征。NTg和多重ALS模型小鼠微泡蛋白载量(A–C)或人类脊髓组织(D–F型)通过还原性和非还原性SDS-PAGE和SOD1免疫印迹分析。代表性免疫印迹(A类和D类)，减少车道包括β-巯基乙醇（β-默克.）.碘乙酰胺(碘蟑螂.）以阻止在样品处理过程中形成人工二硫键-周一.，单体带（～17 kDa）；*，聚合带。B类和C类，来自n个=每个基因型2-4个脑MV样本，与所分析的蛋白质量标准化+β-默克/-碘蟑螂。，减少车道；−β-汞/+碘酸盐。，非减速车道。B类、HuSOD1G93A公司右侧报告年轴线；C类，聚合；*，凝胶顶部的带状物。平均值和S.E(误差线)如图所示。差异通过双向方差分析和Sidak的多重比较试验确定。B类,第页=0.2667（相互作用），第页≤0.0001（基因型），以及第页=0.0140（减少）。C、，第页=0.2003（相互作用），第页=0.0031（基因型），以及第页=0.4553（减少）。E类和F类，定量免疫印迹的体积强度n个=4个FALS A4V样品和n个=4个对照样品，归一化为分析的蛋白质量。显示了平均值和S.E。聚合信号(F类)是标记有星号在里面D类. +β-默克./−碘蟑螂。，减少车道；−β-默克./+碘仿。，非减速车道。差异通过双向方差分析和Sidak的多重比较试验确定。E类,第页=0.4012（相互作用），第页=0.5241（疾病状态），以及第页=0.0184（减少）。F类,第页=0.2204（相互作用），第页=0.0466（疾病状态），以及第页=0.0761（减少）。误差线、瑞典。
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