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.2019年3月1日；129(3):1167-1179.
doi:10.1172/JCI122440。 Epub 2019年2月11日。

c-Abl调节YAPY357磷酸化，激活内皮细胞对扰动血流的致动脉粥样硬化反应

李伯川, 金龙河, 吕慧珍, 刘亚金, 薛璐, 张成虎, 易珠, 丁艾

c-Abl调节YAPY357磷酸化，激活内皮细胞对扰动血流的致动脉粥样硬化反应

李伯川等。 临床研究杂志. .

摘要

局部血流模式决定了动脉粥样硬化病变的不均匀分布。本研究旨在阐明在振荡剪切应力（OSS）作用下，内皮细胞（EC）动脉粥样硬化表型Yes-associated protein（YAP）核移位的调控机制。我们在这里报道，OSS导致EC中酪氨酸磷酸化和YAP强烈、持续的核移位，这依赖于整合素α5β1的激活。内皮细胞中YAP的过度表达减弱了Apoe-/-小鼠中整合素α5β1-阻断肽（ATN161）的抗动脉粥样硬化作用。整合素α5β1的激活可诱导EC中YAP的酪氨酸磷酸化，而不是丝氨酸磷酸化。用ATN161阻断整合素α5β1可消除OSS诱导的Y357处YAP磷酸化。机制研究表明，c-Abl抑制剂减弱了整合素α5β1诱导的YAP酪氨酸磷酸化。此外，与正常血管相比，小鼠动脉粥样硬化血管和人类斑块的内皮细胞中c-Abl和YAPY357的磷酸化显著增加。最后，酪氨酸激酶抑制剂博苏替尼显著降低了YAPY357的水平和Apoe-/-小鼠动脉粥样硬化的发展。c-Abl/YAPY357通路是整合素α5β1激活和内皮细胞动脉粥样硬化表型对OSS反应的机制，为动脉粥样硬化的发生提供了潜在的治疗策略。

关键词：动脉粥样硬化；血管生物学；内皮细胞。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：提交人声明，不存在利益冲突。

数字

图1
图1。振荡剪切应力（OSS）通过整合素α5β1增加Yes-associated protein（YAP）核转位。
(A类和B类)将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）暴露于OSS（0.5±4 dyn/cm2)在指定的时间内。接受静态处理（ST）的细胞为对照。治疗后，用YAP（绿色）、指骨样蛋白（红色）和DAPI（蓝色）对细胞进行免疫荧光染色。量化核YAP的百分比。比例尺：20μm。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05与ST（单因素方差分析与Bonferroni多项比较事后检验），n个= 5. (C类和D类)HUVEC暴露于OSS 6小时。YAP亚细胞在细胞核和细胞质中分布的Western blot分析。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05（学生的t吨测试），n个= 6. (E类–H（H）)将HUVEC接种在涂有胶原蛋白（Col）或纤维连接蛋白（FN）（10μg/ml）的培养皿中6小时。(E类)YAP（红色）、Act-α5（绿色）和DAPI（蓝色）的免疫荧光染色。比例尺：20μm。(F类)E组中YAP的核质比和Act-α5的荧光强度。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05（学生的t吨测试），n个=8。(克)核蛋白和细胞质蛋白的Western blot分析检测YAP的表达。(H（H）)面板G中t-YAP的量化。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05（学生的t吨测试），n个=3。(我)HUVEC暴露于OSS或ST中6小时，有或无ATN161（10μmol/l）预处理。YAP（红色）和DAPI（蓝色）免疫荧光染色。比例尺：20μm。(J型)面板I中YAP的核质比。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05（Bonferroni多重比较事后检验的双向方差分析），n个= 6. (K（K）)来自WT（α5）的主动脉弓（AA）和胸主动脉（TA）内外曲YAP（红色）、CD31（绿色）和DAPI（蓝色）的正面免疫染色+/+)和伊特加5+/–(α5+/−)小鼠（8周龄，n个= 5). 比例尺：20μm。
图2
图2。EC特定YAP公司过度表达减弱整合素α5β1阻断的动脉粥样硬化保护作用。
欧盟委员会-YAP公司热重（tg）阿波–/–和YAP公司弗洛克斯阿波–/–给小鼠喂食WTD 4周，期间每3天腹腔注射一次扰民肽（NC）或ATN161（100 mg/kg）。(A类)主动脉油红O染色。比例尺：4 mm(B类)菌斑面积占总面积的百分比。AA，主动脉弓；TA，胸主动脉；NS，不显著。数据为平均值±SEM。YAP公司弗洛克斯阿波–/–+数控(n个= 8),YAP公司弗洛克斯Apoe公司–/–+ATN161型(n个=7），EC-YAP公司热重（tg）Apoe公司–/–+数控(n个=5），EC-YAP公司热重（tg）阿波–/–+ATN161型(n个= 6). *P（P）<0.05（采用Bonferroni多重比较事后检验的双向方差分析）。(C类–E类)主动脉根部HE、油红O和Mac3免疫荧光染色。白色虚线表示斑块的大小。斑块大小、油红O–斑块阳性区域和Mac3阳性区域的量化。数据为平均值±SEM。YAP公司弗洛克斯阿波–/–+数控(n个= 8),YAP公司弗洛克斯阿波–/–+ATN161型(n个=7），EC-YAP公司热重（tg）阿波–/–+数控(n个=5），EC-YAP公司热重（tg）阿波–/–+ATN161型(n个= 6). *P（P）<0.05（采用Bonferroni多重比较事后检验的双向方差分析）。NS，不显著。比例尺：100μm。(F类)血浆甘油三酯（TG）、总胆固醇（CHO）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）水平。数据为平均值±SEM。YAP公司弗洛克斯Apoe公司–/–+数控(n个= 13),YAP公司弗洛克斯阿波–/–+ATN161型(n个=12），EC-YAP公司热重（tg）阿波–/–+数控(n个=10），EC-YAP公司热重（tg）阿波–/–+ATN161型(n个= 11).
图3
图3。OSS通过整合素α5β1诱导Tyr357处YAP磷酸化。
(A类和B类)如图所示，HUVEC接触OSS的时间不同。接受静态处理（ST）的细胞为对照。活化整合素α5（Act-α5）、整合素总α5（t-α6）、p-YAP蛋白水平的Western blot分析第127节，p-YAPS397系列，p-YAPY357年和t-YAP。(B类)量化用t-YAP和t-α5标准化的YAP磷酸化和Act-α5。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05与ST（单因素方差分析与Bonferroni多项比较事后检验），n个=5。(C类和D类)将HUVEC接种在涂有胶原蛋白（Col）或纤维连接蛋白（FN）的培养皿上，培养6小时。活化整合素α5（Act-α5）、整合素总α5（t-α6）、p-YAP蛋白水平的Western blot分析第127节，p-YAP第397页，p-YAPY357年和t-YAP。(D类)量化YAP磷酸化和Act-α5归一化为t-YAP和t-α5。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05（采用Bonferroni多重比较事后检验的单因素方差分析），n个= 5. (E类)HUVEC暴露于OSS或ST 6小时，有或无ATN161（10μmol/l）预处理。活化整合素α5（Act-α5）、整合素β5（t-α6）、p-YAP的Western blot分析第127节，p-YAPS397系列，p-YAPY357年、t-YAP、ICAM-1和VCAM-1。(F类)面板E中指示蛋白质表达的量化。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05（采用Bonferroni多重比较事后检验的双向方差分析），n个= 6.
图4
图4。YAP的Tyr357磷酸化在体内外诱导内皮细胞活化。
(A类和B类)HUVEC感染指示的腺病毒24小时，再暴露或不暴露OSS或ST 6小时。VCAM-1蛋白水平的Western blot分析。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05（采用Bonferroni多重比较事后检验的双向方差分析），n个= 6. (C类和D类)HUVEC在有或无OSS的情况下感染所示腺病毒24小时。用荧光染料标记THP-1细胞，然后进行细胞粘附试验。粘附细胞的代表性图像。比例尺：500μm。在每个孔中计算来自5个随机场的×10目标细胞数。粘附细胞的数量与Ad-GFP感染的HUVEC的数量一致。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05（Bonferroni多重比较事后检验的双向方差分析），n个= 5. (E类)男阿波–/–小鼠接受颈动脉部分结扎。在结扎过程中，向颈动脉注入所示的腺病毒。显示小鼠颈动脉内皮细胞中GFP和VCAM-1表达的免疫荧光染色。比例尺：20μm。(F类)VCAM-1相对荧光强度的量化。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05（学生的t吨测试），n个=6只小鼠。
图5
图5。Src/c-Abl途径参与Tyr357整合素α5β1介导的YAP磷酸化。
(A类–C类)如图所示，将HUVEC接种在涂有纤维连接蛋白或胶原蛋白的培养皿上，在添加或不添加抑制剂（10μmol/l）的情况下培养6小时。(A类和B类)蛋白表达和p-YAP比值的Western blot分析Y357年至t-YAP。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05（采用Bonferroni多重比较事后检验的双向方差分析），n个= 6. (C类)YAP（红色）和DAPI（蓝色）免疫荧光染色。显示代表图像，n个= 6. 比例尺：20μm。(D类和E类)HUVEC暴露于OSS中6小时，加入或不加入波苏替尼（10μmol/l）。(D类)p-YAP的Western blot分析Y357年，p-c-AblY412型、t-YAP、c-Abl和VCAM-1。(E类)面板D中蛋白质水平的量化。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05（采用Bonferroni多重比较事后检验的双向方差分析），n个= 5. (F类)HUVEC转染对照或ABL1公司siRNA 24小时，然后接受OSS或不接受OSS 6小时。c-Abl、p-YAP的蛋白质印迹分析Y357年、t-YAP和VCAM-1。(克)F组蛋白质水平的量化。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05（采用Bonferroni多重比较事后检验的双向方差分析），n个=6。
图6
图6。p-c-Abl公司Y412型和p-YAPY357年在小鼠和人类动脉粥样硬化区的内皮细胞中高度表达。
(A类和B类)6至8周龄的主动脉阿波–/–对小鼠进行免疫荧光染色以检测指示蛋白。主动脉弓分叉；主动脉弓内曲；TA，胸主动脉；五十、 流明。显示代表图像，n个= 6. 比例尺：80μm。(C类和D类)从8周龄的主动脉弓（AA）和TA中提取蛋白质阿波–/–老鼠。(C类)VCAM-1，p-YAP表达的Western blot分析Y357年，t-YAP，p-c-AblY412型、c-Abl和GAPDH在AA和TA内膜的组织裂解物中的表达。(D类)C组蛋白质表达定量。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05（学生的t吨测试）。将3只小鼠的内膜蛋白提取物合并为1个样品，n个= 3. (E类和F类)将人动脉粥样硬化血管分为动脉粥样硬化（AS）组和非动脉粥样硬化组。对血管进行HE染色和免疫荧光染色以检测指示蛋白。黑框表示免疫荧光图像中放大的区域。五十、 流明。显示了具有代表性的图像，n个= 10. 比例尺：1000μm（HE），200μm（免疫荧光）。
图7
图7。Bosutinib可抑制饮食诱导和部分结扎诱导的动脉粥样硬化阿波–/–老鼠。
(A类–E类)每隔3天注射一次博斯替尼（30 mg/kg），持续5周阿波–/–小鼠，从第二周开始喂食WTD。(A类和B类)主动脉的代表性肉眼和油红O染色。比例尺：1.5 mm(A类); 比例尺：4 mm(B类). (C类–E类)主动脉弓B区病变面积的量化；TA，胸主动脉；NS，不显著。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05（学生的t吨测试），n个= 5–6. (F类–H（H）)对左颈总动脉进行部分结扎阿波–/–服用或不服用博斯丁尼的小鼠。代表性图像显示在面板F中，n个= 6. 比例尺：2 mm(F类). (克和H（H）)颈动脉结扎小鼠内皮细胞中VCAM-1和ICAM-1表达的表面免疫荧光染色，n个= 6. 比例尺，20μm。(我)一种拟议的c-Abl/YAP模型，在EC激活和动脉粥样硬化中受振荡流调节。
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