A cellular complex of BACE1 and γ-secretase sequentially generates Aβ from its full-length precursor

doi:10.1083/jcb.201806205

.2019年2月4日；218(2):644-663.

doi:10.1083/jcb.201806205。 Epub 2019年1月9日。

BACE1和γ-分泌酶的细胞复合体从全长前体序列生成Aβ

刘雷（Lei Liu）¹, 李丁¹, 马泰奥·罗维尔¹, 迈克尔·S·沃尔夫², 丹尼斯·J·塞尔科^三

附属机构

¹马萨诸塞州波士顿哈佛医学院布里格姆女子医院神经内科安·罗姆尼神经疾病中心。
²堪萨斯大学药学院，药物化学系，堪萨斯州劳伦斯。
^三马萨诸塞州波士顿哈佛医学院布里格姆女子医院神经内科安·罗姆尼神经疾病中心dselkoe@bwh.harvard.edu。

PMID： 30626721
预防性维修识别码： PMC6363461型
内政部： 10.1083/jcb.201806205

BACE1和γ-分泌酶的细胞复合体从全长前体序列生成Aβ

刘雷（Lei Liu）等。 J细胞生物学. 2019.

.2019年2月4日；218(2):644-663.

doi:10.1083/jcb.201806205。 Epub 2019年1月9日。

作者

刘雷（Lei Liu）¹, 李丁¹, 马泰奥·罗维尔¹, 迈克尔·S·沃尔夫², 丹尼斯·J·塞尔科^三

附属机构

¹马萨诸塞州波士顿哈佛医学院布里格姆女子医院神经内科安·罗姆尼神经疾病中心。
²堪萨斯大学药学院医学化学系，堪萨斯州劳伦斯。
^三马萨诸塞州波士顿哈佛医学院布里格姆女子医院神经内科安·罗姆尼神经疾病中心dselkoe@bwh.harvard.edu。

PMID： 30626721
预防性维修识别码： PMC6363461型
内政部： 10.1083/jcb.201806205

摘要

早老素-γ-分泌酶复合物对跨膜底物的膜内蛋白水解是通过α-或β-分泌酶脱落底物的外结构域进行的。我们询问β-和γ-分泌酶是否相互作用，以调节APP的有效顺序处理，生成淀粉样β（Aβ）肽，从而引发阿尔茨海默病。我们描述了一种迄今尚未被认识的含有活性β-和γ-分泌酶的多蛋白酶复合物。BACE1在培养细胞、小鼠和人脑中与γ-分泌酶共免疫沉淀和共分离。含有β-和γ-分泌酶和holo-APP的内源性高分子量（HMW）复合物（～5 MD）在体外具有催化活性，并生成一系列生理aβ42/40比率的aβ肽。分离的复合物对γ-分泌酶调节剂有适当的反应。早老素的阿尔茨海默病样突变改变了HMWβ/γ-分泌酶复合物产生的Aβ42/40肽比率，与在整个细胞中观察到的比率无明显区别。因此，Aβ是由BACE1-γ-分泌酶复合物从holo-APP产生的，该复合物提供全长底物到最终产物的连续、有效的RIP处理。

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数字

**图1。**
**在WT小鼠脑微粒体裂解物中，β-分泌酶BACE1在内源性水平上与γ-分泌酶相互作用。（A）**将1%CHAPSO溶解的WT小鼠脑微粒体裂解物免疫沉淀为BACE1或ITGα1、ITGα2和ITGβ1作为对照。免疫印迹法检测γ组分NCT和PS1-NTF的coIP。**（B）**将1%CHAPSO溶解的WT小鼠脑微粒体裂解物加载到BN-PAGE上，然后进行二维SDS-PAGE，并用所示蛋白的抗体进行印迹。*，非特异性信号；m和im，成熟和不成熟的形式。

**图2。**
**BACE1与γ-分泌酶存在于FPLC从小鼠脑中分离的HMW复合体中，具有蛋白水解活性。（A）**用FPLC在Superose 6 Increase SEC柱上分离1%CHAPSO溶解的WT小鼠脑微粒体，并用所示蛋白的抗体进行印迹。**（B）**FPLC组分合并为HMW（6–9）或LMW（21–24）组分，并对BACE1进行免疫沉淀，然后用所示蛋白的抗体进行印迹。请注意，免疫沉淀的BACE1数量不同，可能不一定反映输入中的数量。**（C）**FPLC组分用APP的某些抗体进行印迹（顶部两个面板，C7；底部面板，1G6）。**（D）**FPLC组分与荧光BACE1肽底物孵育。在37°C下孵育2小时后，荧光读数为BACE1活性(n个= 3; 误差条为SD）。**（E）**在不存在或存在两种不同的β-分泌酶抑制剂（AZD3293和抑制剂IV，各为10µM）的情况下，免疫沉淀0.25%CHAPSO溶解的WT小鼠脑微粒体以检测γ-分泌酶（抗-NCT），或以其他抗-TfR作为对照。对从IP树脂中提取的洗脱液进行β-分泌酶活性测定。n个=NCT IP为5，n个=TfR IP为2；错误条为SD。未配对学生的t吨测试：**，P<0.01；***，P＜0.001。**（F）**对来自WT小鼠大脑的混合HMW和LMW FPLC组分进行γ-分泌酶（抗NCT）免疫沉淀。对从IP树脂（未配对学生的t吨测试：**，P<0.01，n个= 3; 误差条为SD）。

**图3。**
**HEK293-swAPP细胞微粒体HMW FPLC部分的从头生成Aβ。（A）**HEK293/swAPP细胞1%CHAPSO溶解微粒体的FPLC部分（Superose 6 Increase柱）用所示蛋白的抗体进行了印迹。**（B）**将未分馏的微粒体加载到2D BN/SDS-PAGE上，并对PS1-NTF进行印迹。**（C）**FPLC组分在37°C下孵育12 h。浓缩后，通过ELISA对每个组分的Aβx-40和x-42从头生成进行量化；左y轴，Aβx-40；右y轴，Aβx-42(n个= 3; 平均值±SD）。如下：计算Aβx-42/x-40的相对比值；紫色线代表0.2。**（D）**FPLC部分在37°C下用L685458（5µM）和DMSO作为对照培养12小时。在浓缩后用ELISA测定每个组分的βx-40/x-42新生代(n个= 2; 平均值±SD）。**（E）**与D中一样，以10µM JNJ-40418677或DMSO作为对照，在37°C下培养组分#1-24 12小时。用ELISA测定每个组分的Aβx-37/x-40/x-42新生代(n个= 2; 平均值±SD；未配对学生的t吨测试：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001）。**（F）**在Superse 6 Increase柱上对HEK293/swAPP中用2.5µM AZD3293预处理24 h（DMSO作为对照）的1%CHAPSO溶解微粒体进行分馏，并在37°C下培养12 h。通过ELISA测定每个组分的βx-40从头生成(n个= 3; 平均值±SD）；未成对学生的t吨测试：**，P<0.01；****，P<0.0001。**（G）**用2.5µM AZD3293或DMSO处理细胞24小时后，在37°C重新孵育前，FPLC组分的Holo-APP和PS1-NTF免疫印迹（M，成熟；im，不成熟；DARK，更长时间暴露）。

**图4。**
**免疫隔离HMW复合物中holo-APP从头生成Aβ。（A）**在Sephacryl S-300 HR SEC柱上对1%CHAPSO增溶的HEK293 swAPP微粒体进行分级，并将级分#1–8在37°C下孵育12小时。通过ELISA测量每个FPLC级分的βx-37、x-40和x-42新生代(n个= 1). 在孵育前，还测量了每个组分中的Aβx-40(n个= 1). 左y轴，Aβx-40；右y轴，Aβx-42和Aβx-37。**（B）**FPLC组分#1在37°C下与2.5、7.5或25µM E2012或JNJ-40418677孵育12小时。通过ELISA测定每个组分的新生Aβx-42/x-40/x-37代(n个= 2; 平均值±SD）。未付费学生的t吨测试：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P＜0.001。**（C）**如图所示，使用四种不同抗体从FPLC组分#2-5中提取IP后，将免疫沉淀珠在37°C的500µl反应缓冲液中培养12 h。在反应缓冲液内测量新生代Aβx-40和x-42(n个= 2; 平均值±SD）。来自#5的IP未生成任何可测量的Aβ，因此未显示。

**图5。**
**从人脑裂解物的HMW FPLC部分从头生成Aβ。（A）**使用Superose 6 Increase列中的分数从人脑生成从头生成Aβ的方案示意图。**（B）**在柱上分离1%CHAPSO溶解的人脑微粒体，并用所示蛋白的抗体进行印迹。**（C）**分馏B中的微粒体，并在37°C下用荧光BACE1肽底物IV孵育每个部分2小时(n个=3，平均值±SD）。**（D）**FPLC组分在37°C下孵育12 h。通过ELISA测定每个组分的新生Aβx-40代(n个=2，平均值±SD）。**（E）**FPLC组分在37°C下孵育12小时，以指示的抑制剂和二甲基亚砜为对照。用ELISA法测定浓缩后每个组分的新生Aβx-40代(n个=2，平均值±SD）。未付费学生的t吨检验：*，P<0.05。**（F）**FPLC部分在37°C下与10µM JNJ-40418677或仅DMSO孵育12小时。在浓缩后，通过ELISA测定每个组分的新生Aβx-40/x-37代(n个=3，平均值±SD）。未付费学生的t吨测试：*，P<0.05；***，P<0.001；****，P<0.0001。

**图6。**
**RA破坏HMWβ/γ复合物的稳定性并调节γ-分泌酶活性以减少Aβ的产生。（A）**RA的结构。**（B）**用RA处理HEK293-swAPP细胞24小时后，通过ELISA测定培养基中的Aβ1-x（剂量为390 nM至50µM；n个=2，平均值±SD；一些误差条太小而不可见）。黑线，Aβ1-x水平，纯DMSO处理。**（C）**用50µM RA、DMSO和10µM LY2811376（LY）作为对照，处理HEK293-swAPP细胞24小时后，用ELISA测定细胞外和细胞内Aβ1-x(n个=6，平均值±SD）。未付费学生的t吨测试：**，P<0.01；****，P<0.0001。**（D）**以DMSO（黑线）为对照，增加RA剂量24小时后，用ELISA法测定同一细胞系sAPPβ-sw的分泌(n个=3，平均值±SD；一些错误栏太小，无法看到）。**（E）**用50µM RA处理24小时的同一细胞系的裂解物的免疫印迹，以DMSO或10µM LY2811376或10μM DPAT作为对照。**（F）**用RA或DMSO（黑线；n个= 4; 平均值±SD；一些误差条太小而不可见）。**（G）**来自同一细胞系的微粒体用25µM RA预处理24小时（DMSO作为对照），并在Superose 6 Increase柱上分馏。将组分在37°C下孵育12 h。通过ELISA测定新生代Aβx-40/x-42，并绘制Aβx-42/x-40比率(n个=3，平均值±SD）。未付费学生的t吨测试：**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001。**（H）**在重新孵育之前，用所示蛋白的抗体对FPLC组分进行印迹。**（一）**用增加剂量的RA处理in细胞，DMSO设置为1时，正常化的Aβx-42/40和Aβx-38/42比率(n个=6，平均值±SD；有些条太小，看不见）。

**图7。**
**RA不抑制BACE1或γ分泌酶。（A）**)用50µM RA或DMSO处理24小时后，在条件培养基中测量Aβx-40和Aβx-42(n个=6，平均值±SD）。未付费学生的t吨测试：****，P<0.0001。**（B）**使用荧光BACE1活性测定测试500 ng重组BACE1（50µM RA或10µM LY2811376和DMSO作为对照）(n个=3，平均值±SD；未成对学生的t吨测试：****，P<0.0001）。仅使用荧光底物作为空白对照。**（C）**以二甲基亚砜为对照（黑线；n个= 1).（D）以二甲基亚砜（DMSO）为对照，增加AZD3293或L685458的剂量，24小时后通过ELISA定量细胞内APP-CTFβ（黑线；n个= 1).（E）将来自用二甲基亚砜或50µM RA处理的同一细胞系的1%CHAPSO溶解微粒体稀释20-640倍，并与荧光BACE1底物IV一起孵育，并测量活性(n个= 1).（F）用DMSO或50µM RA处理同一细胞系的1%CHAPSO溶解微粒体，然后在Superose 6 Increase柱上分馏。BACE1活性按E测定(n个=3，平均值±SD；未成对学生的t吨测试：*，P<0.05；***，P<0.001）。**（G）**以二甲基亚砜（DMSO）作为HEK293-swAPP细胞的对照（黑线），增加RA剂量24小时后，用ELISA法测定Aβx-37、x-38、x-40和x-42(n个=4，平均值±SD；一些错误栏太小，无法看到）。**（H）**在50µM至390 nM的一系列剂量的D23 in细胞上用RA处理24小时后，通过ELISA测定培养基中的Aβ1-x、x-37、x-38、x-40和x-42(n个=6，平均值±SD；有些误差条太小，无法看到；黑线、DMSO）。

**图8。**
**新生Aβ的产生密切反映了WT PS1-和FAD突变PS1-表达细胞中全细胞Aβ的分泌。（A和B）**在Superose 6 Increase柱上对从所示HEK293细胞系制备的1%CHAPSO溶解微粒体进行分馏，并将组分#1-24在37°C下培养12 h。在浓缩后，通过ELISA对每个组分的新生aβx-40/x-42代进行测定(n个= 3; 平均值±SD）。**（C）**所示细胞系中第5–17组分的平均新生Aβx-42/x-40比率。**（D）**24小时条件培养基中与C细胞相同的细胞分泌Aβx-42/40的比率(n个=3，平均值±SD；****，P<0.0001）。

**图9。**
**共聚焦显微镜、PLA和STED纳米显微镜对HEK293细胞中BACE1和γ-分泌酶共定位的分析。（A）**HEK293细胞的1-μm光学切片染色BACE1（绿色）、PS1（红色）和DAPI（蓝色），用共焦显微镜观察。**（B）**原位PLA染色，通过共焦显微镜低倍镜显示BACE1/PS1或TfR/PS1信号（红色）和DAPI（蓝色）之间的相互作用。**（C）**B.高倍放大。**（D）**BACE1/PS1（119个细胞）之间五帧图像中PLA信号的量化，以TfR/PS1（106个细胞）作为阴性对照。未付费学生的t吨测试：n个=5，平均值±SEM；**，P<0.01。**（E）**HEK293细胞BACE1（绿色）和PS1（红色）免疫反应斑点的超分辨STED图像。一些共同定位的点用红色圆圈标记。

**图10。**
**HMWβ/γ分泌酶复合物的机制示意图。（A）**HMW复合物和不同复合物处理效果的概要说明。**（B）**膜脱落事件的两个潜在途径：主要是外胚层脱落和主要是连续的底物裂解。

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1. Bai X.C.、Yan C.、Yang G.、Lu P.、Ma D.、Sun L.、Zhou R.、Scheres S.H.W.和Shi Y.2015b人类γ-分泌酶的原子结构。自然。525:212–217. 10.1038/性质14892-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学
1. Baranger K.、Khrestchatisky M.和Rivera S.，2016年。MT5-MMP，只是阿尔茨海默病中一种新的APP处理蛋白酶？J.神经炎症。13:167 10.1186/s12974-016-0633-4-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学
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[7] Bolduc D.M.、Montagna D.R.、Gu Y.、Selkoe D.J.和Wolfe M.S.。2016a Nicastrin的功能是立体阻止由底物跨膜结构域驱动的γ-分泌酶-底物相互作用。程序。国家。阿卡德。科学。美国113:E509–E518。10.1073/pnas.1512952113-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学

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