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.2019年1月8日；10(1):76.
doi:10.1038/s41467-018-08026-8。

血小板反应蛋白-3通过细胞内整合素抑制和肌膜不稳定增加损伤诱导的心肌病

托拜厄斯·斯基普斯 1, 戴维·范霍特 1, 亚历山大·沃伊 1, 罗伯特·科雷尔 1, 马修·布罗迪 1, 哈迪·哈利勒 1, 杰森·卡奇 1 2, 安多莉亚·特约安德罗科埃索莫（Andoria Tjondrokoesoemo） 1, 米歇尔·萨金特 1, 马乔丽·梅莱特 1, 罗伯特·罗斯 三, 杰弗里·德·莫尔肯廷（Jeffery D Molkentin） 4 5
附属公司

血小板反应蛋白-3通过细胞内整合素抑制和肌膜不稳定增加损伤诱导的心肌病

托拜厄斯·斯基普斯等。 国家公社. .

摘要

血栓反应蛋白（Thbs）是脊椎动物中五种分泌的基质细胞糖蛋白家族，广泛影响细胞-基质相互作用。虽然已知Thbs4通过增加整合素和肌营养不良聚糖附着复合物来增强肌膜稳定性，从而保护横纹肌免受疾病的侵袭，但我们在此表明，Thbs3通过降低整合素功能，增强疾病诱导的失代偿，从而反向促进肌膜失稳。小鼠Thbs3的缺失增强了整合素膜的表达和膜的稳定性，保护心脏免受疾病刺激。心脏中α7β1D整合素的转基因过度表达通过增强肌膜稳定性改善Thbs3的疾病易感效应。从机制上讲，我们表明，将Thbs3突变为包含通常在Thbs4和Thbs5中发现的保守RGD整合素结合域，现在可以挽救整合素在肌膜上的缺陷表达。因此，Thbs蛋白介导整合素质膜附着复合物的细胞内处理，以调节细胞重塑和膜稳定性的动力学。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
Thbs3在患病心脏中表达，并诱导适应性内质网应激反应。一定量来自Thbs3的Western blots的相对蛋白表达，这些Thbs3来自于接受2周TAC的小鼠心脏组织，这些小鼠含有活化的钙调神经磷酸酶A转基因（CnA）或缺乏Csrp3号机组基因*P（P） < 通过单向方差分析和土耳其多重比较测试，0.05 vs假手术组。结果来自四个实验，误差条代表+/-SEM。b条12周后，Thbs3蛋白（绿色）、结蛋白（红色）以及两者与DAPI（蓝色）假手术或TAC手术心脏合并的免疫组织化学。比例尺为10 微米。c（c）8周龄CnA转基因心脏Thbs3（红色）和PDI（绿色）的代表性免疫组化。比例尺为10 微米。d日描绘由四环素调节的诱导型双转基因系统用于心脏中Thbs3的诱导型过表达的示意图。e（电子）来自tTA对照组和Thbs3 DTG小鼠心脏的Thbs3、ATF6α、Armet、BiP、钙网蛋白（CRT）和Gapdh的代表性Western blot。（f）感染表达Myc-tagged ATF6α和βgal或Thbs3的重组腺病毒的新生大鼠心室肌细胞（NRVM）Thbs3蛋白质印迹。显示了带有Myc-tagged ATF6α的Thbs3的输入控制和免疫沉淀（IP）。克tTA对照组和Thbs3 DTG小鼠心脏Thbs3（红色）、WGA（绿色）或PDI（绿色）和DAPI（蓝色）的代表性免疫组织化学。比例尺为10 微米。小时tTA对照组和Thbs3 DTG小鼠心脏切片的透射电子显微镜（EM）。白色箭头显示仅Thbs3 DTG心脏中扩张的ER和小泡。比例尺为1 微米
图2
图2
心脏特异性Thbs3过度表达会增加损伤后的病理变化。一TAC术后12周，tTA对照组和Thbs3 DTG心脏组织切片的低倍图像用Masson三色染色。比例尺为1 毫米。b条TAC或假手术后12周的心脏重量/体重比（HW/BW）。c（c）超声心动图测量缩短分数（FS）百分比和d日舒张期（LVIDD）和收缩期（LVIDS）的左心室尺寸。e（电子）在指定的小鼠组中，通过肺重量与体重（LW/BW）的比值分析肺水肿。（f）用Masson三色染色的心脏切片定量纤维化面积的百分比。克心肌梗死手术后4周，tTA对照组和Thbs3 DTG心脏的低倍组织学图像用Masson三色染色。比例尺为1 毫米。小时在指定的小鼠组中，MI或Sham手术后4周的HW/BW比率。我部分缩短（FS）百分比和j个超声心动图测量LVIDD和LVIDS。直方图上显示了每个程序中分析的每组动物数量*P（P） < 0.05与tTA对照组假手术；#P（P） < 0.05 vs.tTA TAC或MI。采用单因素方差分析和土耳其多重比较检验进行统计分析。误差条是平均值的+/-标准误差，每个实验中使用的小鼠数量如图所示
图3
图3
Thbs3降低表面整合素水平并破坏肌膜的稳定性。一对tTA对照组、Thbs3 DTG和Thbs4 DTG小鼠心脏肌膜蛋白提取物的代表性Western blots进行整合素蛋白和β-dystroglycan分析。层粘连蛋白2α2和Cacna1c用作加载控制。定量如补充图3a-k所示。红色方框显示Thbs3在肌膜上特异性降低的整合素蛋白。b条免疫沉淀前微粒体蛋白提取物输入的Western blots用于检测感染Adβgal或AdThbs3的NRVMs的Thbs3、β1D整合素和Cacna1c（左图）。然后，对微粒体部分进行β1整合素免疫沉淀（IP），并对指示的蛋白质进行印迹（右图）。小鼠IgG被用作IP的对照。c（c）伊文思蓝染料（EBD）和异丙肾上腺素（Iso，300）的方案 mg/kg）注射，测定小鼠心脏膜通透性。d日取自3 tTA对照组和3 Thbs3 DTG小鼠的代表性组织学心脏切片，对WGA（绿色荧光）和EBD通过红色荧光渗入心肌细胞进行成像，实验方案如c（c）。比例尺为1 毫米。e（电子）埃文斯蓝染料（EBD）注射方案在TAC手术后测量成年小鼠的膜通透性。处死小鼠（Sac）24 EBD注射后h，TAC手术后1周。（f）,克TAC术后1周，tTA对照组和Thbs3 DTG心脏的代表性心脏组织学图像根据实验方案用WGA（绿色）和EBD细胞内渗漏（红色）染色e（电子），同时克显示了这些小鼠心脏中EBD阳性细胞的定量。比例尺为100 微米*P（P） < 0.05与tTA对照组假手术；双尾学生T型-测试。数据以EBD阳性细胞百分比表示（≥8只动物的≥3000个细胞）。误差条是平均值的+/-标准误差，使用的老鼠数量在图表中显示为单个数据点
图4
图4
Thbs3缺失可保护心脏免受压力过载病理的影响。一WT和Thbs3型−/−TAC或假手术后12周，小鼠被Masson三色染色。比例尺 = 1 毫米。b条TAC或假手术后12周，指定小鼠组的HW/BW比值。c（c）超声心动图测量缩短分数（FS）百分比和d日TAC或假手术后12周，指定小鼠组的LVIDD。e（电子）在TAC或假手术12周后，通过LW/BW比值测量分析指定组小鼠的肺水肿。（f）用Masson三色染色的心脏切片在WT和Thbs3型−/−TAC后的小鼠。克WT和WT心脏肌膜蛋白提取物整合素蛋白的代表性Western blotsThbs3型−/−小鼠TAC或假手术后12周。Cacna1c用作加载控制。这些结果的定量如补充图4a-f所示*P（P） < 0.05与WT对照组假手术；#P（P） < 0.05与WT TAC。使用单向方差分析和土耳其多重比较测试以及双尾学生进行统计分析T型-测试。误差条是平均值的+/-标准误差，每个实验中使用的小鼠数量如图所示
图5
图5
心脏损伤后内源性Thbs3的诱导是有害的。一用于选择性分析内源性Thbs3影响的Thbs基因缺失小鼠示意图。b条1-3日龄野生动物心脏的典型蛋白质斑点，第1/2/3/4/5页−/−和第1/2/4/5页−/−小鼠的Thbs蛋白。Gapdh用作加载控制。c（c）卡普兰–shams的Meier生存情节，WT，第1/2/3/4/5页−/−和第1/2/4/5页−/−小鼠TAC手术后数天。每组使用的小鼠数量如图所示。P（P） < 0.0001通过log-rank测试WT与第1/2/4/5页−/−和厚度1/2/3/4/5−/−与第1/2/4/5页−/−.d日向所示小鼠组注射EBD和Iso的实验方案(e（电子）)测量膜的渗透性。e（电子）在Iso注射后，按照图1所示方案对指定小鼠组的心脏EBD阳性区域进行定量d日. *P（P） < 0.05与WT；#P（P） < 0.05与第1/2/4/5页−/−老鼠。采用单因素方差分析和土耳其多重比较检验进行统计分析。误差条是平均值的+/-标准误差，每个实验中使用的小鼠数量如图所示。（f）WT心脏切片β1D整合素的免疫组化，Thbs3型−/−,第1/2/4/5页−/−和第1/2/3/4/5页−/−小鼠TAC术后1周。比例尺为50 微米。克WT心脏整合素蛋白的代表性蛋白质印迹，Thbs3型−/−,第1/2/4/5页−/−、和第1/2/3/4/5页−/−小鼠接受1周的TAC，并进行肌膜蛋白提取物处理。Cacna1c用作加载控制。这些结果的量化如补充图4g–i所示
图6
图6
整合素过度表达可减少Thbs3介导的膜不稳定性和疾病。一用于产生组合Thbs3 DTG，α7β1D整合素TG小鼠的繁殖示意图。b条从tTA、Thbs3 DTG、α7β1D整合素TG和Thbs3-DTG小鼠心脏肌膜蛋白提取物中的Thbs3和指示整合素蛋白的代表性Western blot。α1Na+/K（K）+-ATP酶起负荷控制作用。c（c）Iso（300）后心脏组织切片EBD阳性区域的量化 mg/kg）注射Thbs3 DTG、α7β1D整合素TG、Thbs4 DTG和Thbs3-DTG/α7β1整合素TG小鼠。d日Iso注射后用WGA-FITC（绿色）染色的tTA、Thbs3 DTG和Thbs3-DTG/α7β1D整合素TG小鼠心脏切片的代表性组织学图像（300 毫克/千克）。EBD显示为红色荧光。比例尺为300 微米。e（电子）连续输注Iso（60 mg/kg/天）或PBS车辆控制。分析的小鼠数量显示在每个直方图中c（c）,e（电子）. *P（P） < 0.05与治疗组相比#<0.05与Thbs3 DTG（带Iso）。采用单因素方差分析和土耳其多重比较检验进行统计分析。误差线是平均值的+/-标准误差
图7
图7
Thbs3增强分泌途径活性，但降低膜整合素。一感染GalNac-T2-RFP杆状病毒和指示腺病毒的培养新生儿心室肌细胞（NRVMs）细胞内转运荧光变化的时间进程。数据显示了FRAP后高尔基体网络中GalNac-T2-RFP恢复的定量时间过程，以测量ER-高尔基体囊泡贩运*P（P） < 0.05与Adβgal感染的细胞相比。b条iFRAP后高尔基体中VSVG-eGFP荧光损失的定量时间过程，作为高尔基体到膜（高尔基体出口）囊泡运输的测量*P（P） < 0.05与Adβgal感染细胞相比。采用双向方差分析和土耳其多重比较检验进行统计分析。c（c）使用tTA、Thbs3 DTG和Thbs4 DTG小鼠心脏细胞外基质提取物在基线或TAC刺激下进行ECM蛋白的Western blot。图中显示了一种银染凝胶，带有一个非特异性（n.s.）带作为负载控制。d日,e（电子）iFRAP后高尔基体α5整合素-GFP荧光丢失的定量时间过程，作为α5整合素高尔基体膜泡囊运输的测量。数据由COS-7细胞α5整整素-GFP-的iFRAP生成d日转染含有所示cDNA的质粒或e（电子）以重组Thbs3或Thbs4蛋白或牛血清白蛋白（BSA）作为对照*P（P） < 0.05与Adβgal转染细胞相比#<0.05与Thbs3转染细胞相比。采用双向方差分析和土耳其多重比较检验进行统计分析。将四个独立实验的结果相加，误差条为平均值的+/-标准误差
图8
图8
Thbs3增强整合素周转。一——小时细胞表面生物素化蛋白用于输入控制实验或用链霉亲和素免疫沉淀（表面，一——d日)诱导细胞内蛋白摄取30 min，然后用链霉亲和素免疫沉淀（摄取，e（电子）——小时). 定量分析感染Adβgal、AdThbs3、AdThbs 4、AdThb 3-RGD腺病毒或经重组Thbs3蛋白治疗的NRVM的β1D整合素、α5整合素，钙网蛋白（CRT）和钙连蛋白（CXN）的蛋白带强度（用于定量的western blot在未截取的westernblot图像附件中显示）。数据表示为相对于输入控制的Adβgal的折叠表达*P（P） < 0.05与Adβgal。采用单因素方差分析和土耳其多重比较检验进行统计分析。误差条是平均值的+/-标准误差，图中显示了独立实验的数量
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