Identification of calnexin as a diacylglycerol acyltransferase-2 interacting protein

doi:10.1371/journal.pone.0210396

.2019年1月7日；14（1）：e0210396。

doi:10.1371/journal.pone.0210396。 2019年eCollection。

calnexin作为二酰甘油酰基转移酶-2相互作用蛋白的鉴定

柯蒂斯·勃兰特¹, 帕梅拉·麦克菲¹, Huyen Vu公司¹, 保罗斯·丘马拉², 乔治·S·凯塞利斯², 斯科特·J·斯通¹

附属公司

¹加拿大萨斯喀彻温省萨斯卡通市萨斯喀彻温大学生物化学、微生物学和免疫学系。
²加拿大萨斯喀彻温省萨斯卡通市萨斯喀彻温大学医学系和加拿大农业健康与安全中心。

PMID： 30615684
预防性维修识别码： PMC6322727型
内政部： 10.1371/新闻稿.0210396

calnexin作为二酰甘油酰基转移酶-2相互作用蛋白的鉴定

柯蒂斯·勃兰特等。公共科学图书馆一号. 2019.

.2019年1月7日；14（1）：e0210396。

doi:10.1371/journal.pone.0210396。 2019年eCollection。

作者

柯蒂斯·布兰特¹, 帕梅拉·麦克菲¹, Huyen Vu公司¹, 保罗斯·丘马拉², 乔治·S·卡塞利斯², 斯科特·J·斯通¹

附属公司

¹加拿大萨斯喀彻温省萨斯卡通市萨斯喀彻温大学生物化学、微生物学和免疫学系。
²加拿大萨斯喀彻温省萨斯卡通市萨斯喀彻温大学医学系和加拿大农业健康与安全中心。

PMID： 30615684
预防性维修识别码： PMC6322727型
内政部： 10.1371/新闻稿.0210396

摘要

三酰甘油的合成由酰基辅酶A：二酰甘油酰基转移酶2（DGAT2）催化。DGAT2是一种定位于内质网并与脂滴相互作用的完整膜蛋白。使用检测近端和相互作用蛋白的BioId方法，我们将calnexin鉴定为DGAT2相互作用蛋白。免疫共沉淀和近距离结扎试验证实了这一发现。我们发现，缺乏钙联蛋白的小鼠胚胎成纤维细胞降低了细胞内三酰甘油水平，并减少了大的脂滴（>1.0μm2面积）。尽管三酰甘油代谢发生了变化，但体外DGAT2活性、定位和蛋白质稳定性不受calnexin缺乏的影响。

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数字

**图1。BioId/DGAT2定位于ER和脂滴。**
(A类)小鼠DGAT2在框架内融合到Myc-tagged生物素连接酶的C末端。得到的融合蛋白约为77kDa。免疫荧光显微镜检测BioId/DGAT2。(B类)用BioId/DGAT2转染COS-7细胞，并用抗Myc（红色）检测。用FL-DGAT2（绿色）联合转染细胞，观察ER。(C类)用或不使用0.5 mM油酸盐处理表达BioId/DGAT2（红色）的细胞12小时。用Bodyy 493/503（绿色）观察脂滴。(D类)生物素化蛋白质的检测。表达BioId/DGAT2的COS-7细胞按照(C类)使用或不使用50μM生物素12 h。使用抗Myc（红色）检测BioId/DGAT2，使用链霉亲和素488（绿色）检测生物素化蛋白。比例尺=10μm。

**图2。BioId/DGAT2生物素化蛋白质的亲和纯化。**
表达BioId/DGAT2的HEK-293T细胞与或不与50μM生物素孵育12 h(A类)抗Myc和(B类)链霉亲和素HRP分别检测BioId/DGAT2和生物素化蛋白。对照组：表达LacZ的细胞。(C类)表达BioId/DGAT2的HEK-293T细胞在加入或不加入50μM生物素和0.5 mM油酸盐的情况下培养12 h。生物素化蛋白用磁性链霉亲和素珠捕获，用SDS-PAGE分离，并用链霉亲和素-HRP检测。(D类)用于凝胶内消化和质谱分析的生物素化蛋白质的分离。生物素化蛋白质(C类)用生物安全考马斯亮蓝G-250染色。

**图3。通过联合免疫沉淀和质谱法鉴定calnexin作为DGAT2相互作用蛋白。**
(A类)用FL-DGAT2或myc-DGAT2转染HEK-293T细胞。用抗FLAG琼脂糖从洗涤剂溶解材料中免疫沉淀FL-DGAT2。免疫沉淀物（IP）用SDS-PAGE分离，然后用抗DGAT2进行检测。(B类)免疫印迹法在抗FLAG免疫沉淀物中检测到Calnexin，但未检测到PDI。HC；沉重的链条。(C类)检测到DGAT2与calnexin的相互作用就地使用近距离结扎分析。表达FL-DGAT2或Myc-DGAT2的COS-7细胞用小鼠抗FLAG抗体和兔抗calnexin抗体染色。使用Duolink检测试剂盒检测相互作用信号（红色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺=10μm。

**图4。小鼠3T3-L1脂肪细胞分化过程中Calnexin蛋白的丰度。**
在脂肪细胞分化的不同日子，从3T3-L1细胞制备细胞裂解物。蛋白质样品通过SDS-PAGE分离，并进行calnexin和GAPDH免疫印迹。数据是三个实验的平均值。*，第页<0.01，第0天与第4天和第7天。

**图5。calnexin缺乏MEF中脂滴尺寸减小。**
(A类)免疫印迹显示在*Cnx2号*^–/–MEF公司。(B类)*Cnx2号*^+/+和*Cnx2号*^–/–MEF与0.5 mM油酸盐孵育12 h，然后用Bodyy 493/503和DAPI染色。比例尺，10μm。脂滴数(C类)和面积(D类)使用ImageJ（美国国立卫生研究院，rsb.info.nih.gov/ij）进行定量。*，第页<0.001,*Cnx2号*^+/+ *与Cnx2相比*^–/–MEF公司。从17到25个细胞计算每个细胞的平均脂滴数和脂滴面积。(E类)脂质提取自*Cnx2号*^+/+和*Cnx2号*^–/–使用或不使用0.5 mM油酸盐处理MEF 12小时。数据是重复进行的三个实验的平均值。*，第页<0.001,*Cnx2号*^+/+ *与Cnx2相比*^–/–含油酸的MEF。(F类)体外DGAT1和DGAT2活动来自*Cnx2号*^+/+和*Cnx2型*^–/–细胞提取物。数据是一式三份的两个实验的平均值。

**图6。在缺乏calnexin的情况下，DGAT2的亚细胞定位和稳定性没有改变。**
(A类)用抗calnexin的免疫印迹显示用shRNAs有效沉默HEK-293T细胞中的calnexin（顶面板）。对照（NT）是指用非靶向shRNA转导的HEK-293T细胞。底部面板显示用FL-DGAT2瞬时转染的非靶向和calnexin击倒细胞（2条右通道）。未转染细胞（Untrans.）是左边的两条通道。(B类)用SDS-PAGE分离总细胞提取物（TCE）、粗线粒体（Cr.Mito）和微粒体（Micro.），并用抗FLAG、抗PDI和HSP70抗体进行免疫印迹。(C类)用FL-DGAT2转染非靶向细胞和calnexin敲除细胞，并用0.5 mM油酸盐处理12 h。固定和渗透后，用抗FLAG和BODIPY 493/503染色细胞，以观察脂滴。比例尺：10μm。(D类)将100μg/mL CHX添加到表达FL-DGAT2的HEK-293T（非靶向和calnexin敲除）细胞的培养基中。在添加CHX后0、1和3小时收集细胞。通过免疫印迹法测定CHX治疗后FL-DGAT2和calnexin的含量。(E类)图6E中数据的量化。数据是三个独立实验的平均值，一式三份。

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