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.2019年1月4日；18(1):1.
doi:10.1186/s12943-018-0930-x。

表观基因上调的癌蛋白PLCE1通过激活PI-PLCε-NF-κB信号通路和VEGF-C/Bcl-2表达，促进食管癌血管生成和增殖

陈云照 1 2, 王丹丹 1, 郝鹏 1, 席晨 1, 韩雪平 1, 洁余 2, 王文杰 1, 梁丽荣 三, 郑刘 三, 一正 4, 胡建明 1, 兰阳 1, 李军（Jun Li） 5, 洪州 6, 崔晓斌 7 8, 冯丽 9 10
附属公司

表观基因上调的癌蛋白PLCE1通过激活PI-PLCε-NF-κB信号通路和VEGF-C/Bcl-2表达，促进食管癌血管生成和增殖

陈云照等。 摩尔癌症. .

摘要

背景：食管鳞状细胞癌（ESCC）是最致命的恶性肿瘤之一。肿瘤发生过程中的新生血管为增殖的肿瘤细胞提供氧气和营养，并充当迁移的管道。靶向参与血管生成的癌基因是治疗器官受限和局部晚期ESCC所必需的。虽然磷脂酶Cε-1（PLCE1）基因最初被鉴定为ESCC的易感基因，但PLCE1如何参与ESCC尚不清楚。

方法：采用矩阵辅助激光解吸电离飞行时间质谱法测量PLCE1启动子区的甲基化状态。为了验证PLCE1在NF-κB信号通路组成激活中的潜在机制，我们使用组织微阵列和癌症基因组图谱数据集，对368例福尔马林固定的食管癌组织和215例正常组织的IHC样本进行了体外和体内分析。

结果：我们报道，在ESCC队列中，低甲基化相关的PLCE1表达上调与肿瘤血管生成和不良预后相关。PLCE1可通过磷脂酰肌醇-磷脂酶C-ε（PI-PLCε）信号通路激活NF-κB。此外，PLCE1可以结合p65和IκBα蛋白，促进IκB-α-S32和p65-S536磷酸化。因此，磷酸化IκBα促进p50/p65的核转位，p65作为一种转录因子，可以结合血管内皮生长因子-C和bcl-2启动子，在体外促进血管生成并抑制凋亡。此外，裸鼠异种移植肿瘤证明，PLCE1可以在体内通过NF-κB信号通路诱导血管生成、抑制细胞凋亡并增加肿瘤侵袭性。

结论：我们的发现不仅证明了低甲基化诱导的PLCE1通过激活PI-PLCε-NF-κB信号通路和VEGF-C/Bcl-2表达，在ESCC中促进血管生成和增殖，但也表明通过表观遗传修饰或选择性抑制剂调节PLCE1可能是治疗ESCC的一种有前景的治疗方法。

关键词：血管生成；食管癌；核因子-κB；PLCE1；增殖。

PubMed免责声明

利益冲突声明

道德批准和参与同意

所有实验均经石河子大学医学院第一附属医院伦理委员会批准。

出版同意书

所有作者同意在年出版手稿分子癌.

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

出版商备注

Springer Nature在公布的地图和机构关联中的管辖权主张方面保持中立。

数字

图1
图1
PLCE1通过异常启动子低甲基化在ESCC中上调。一人类食管鳞癌（临床I-IV期）和正常食管组织中PLCE1表达的IHC染色。b条食管鳞癌患者的Kaplan-Meier总体生存曲线按低水平分层(n个 = 21）和高(n个 = 129）PLCE1的表达(P（P） = 0.002).c（c）正常食管细胞系PLCE1 mRNA表达的GEO数据（GSE9982）分析(n个 = 20） 和食管癌细胞系（n = 20). ***P（P） < 0.0009，非配对双尾学生t检验。d日NCBI/GEO/GSE23400肿瘤及癌旁非肿瘤组织中PLCE1基因表达分析(P（P） = 0.004）。e（电子）癌组织和正常组织中PLCE1表达的GEPIA分析。ESCA：食管癌；LAML：急性髓系白血病；肝细胞癌；*P（P） < 0.05之间。（f）双尾t检验对PLCE1表达的GEO数据分析(*P（P） < 0.05,**P（P） < 0.01,***P（P） < 0.001).克TSS上PLCE1-CpG二核苷酸的基因组结构和ESCC中PLCE1启动子区CpG单元甲基化谱的层次聚类分析(n个 = 132）和正常(n个 = 104). 每个顶点表示一个CpG站点。每列代表一个样本。行是CpG单元的集群，它们是单个CpG站点或CpG节点的组合。白色和红色之间的颜色梯度表示每个样品中每个PLCE1-CpG单元的甲基化（0-56%）。黑色表示数据不足或缺失。小时ESCC和正常人PLCE1启动子平均甲基化的比较。PLCE1启动子靶片段的整体甲基化水平在统计学上较低（0.0957 ± ESCC中0.0456）比正常组织（0.1144） ± 0.0464,P（P） = 0.0001).我ESCC和正常组织之间PLCE1启动子中6个CpG单元的盒图。红色和蓝色斑点代表ESCC和正常组织中一个CpG位点的甲基化状态。黑点是离群值。除了CpG_3和CpG_4外，ESCC患者在CpG_2、CpG5.6、CpG 7.8和Cp G_9.10的平均甲基化水平显著降低（平均甲基化 = 分别为20.25、11.84、8.07、7.20%） = 分别为32.38、13.89、10.52、9.37%；所有的P（P） < 0.05),*P（P） < 0.05,**P（P） < 0.01,***P（P） < 0.001（Mann-Whitney U检验）。j个TCGA Illumina 450中6 CpG位点的甲基化状态与PLCE1的表达均呈负相关 钾铟甲基化芯片。k个根据PLCE1-CpG甲基化对ESCC患者生存时间的Kaplan-Meier分析
图2
图2
PLCE1的过度表达与ESCC的血管生成和增殖有关。一ESCC和正常食管组织标本中PLCE1、CD34和Ki-67染色（200×）的代表性IHC图像。b条ESCC中PLCE1、Ki-67评分及MVD均高于正常食管组织。每个条形代表平均值 ± SD表示三份实验。c、 d日对PLCE1与MVD和Ki-67进行相关性分析。PLCE1与MVD呈正相关，PLCE1和Ki-67也呈正相关。e（电子）根据连续ESCC组织中PLCE1、CD34和Ki-67染色的强度，显示PLCE1，CD34和Ki-67染色代表性IHC图像。（f）与c-kit阴性表达相比，PLCE1阳性表达的IHC的MVD数和Ki-67评分较高。克,小时患者的Kaplan-Meier曲线。高MVD（MVD > 40）组(n个 = 70）和Ki-67-阳性(n个 = 84）与低MVD表达组相比预后较差(n个 = 35）和Ki-67阴性组(n个 = 34)
图3
图3
PLCE1在体外促进ESCC细胞的增殖和血管生成，并在体内诱导侵袭性。一用0、2、5和10浓度的U73122处理Eca109和EC9706细胞24和48 h.以15的MOI转染ShR-PLCE1 60 h.Western blot检测PLCE1表达。b条实时PCR分析显示PLCE1表达和凋亡之间的关系。颜色表示PLCE1 shRNA载体与对照的强度标度，通过log2变换计算得出。c（c）Eca109和EC9706细胞在指定浓度下处理shR-PLCE1或U73122 0、24、48、72和96 h.通过MTT测量细胞活力，并表示为三个独立实验的平均值±SD。d日按指示处理的细胞的TUNEL染色；e（电子）Western blot检测shR-PLCE1对凋亡相关蛋白的影响。β-肌动蛋白为负荷对照。（f）实时PCR分析显示PLCE1表达与血管生成呈正相关。伪彩色表示载体或PLCE1 shRNA与对照的强度标度，通过log2变换计算得出。克通过指示细胞形成管。小时Western blot检测shR-PLCE1对VEGF-C蛋白表达的影响。我裸鼠异种移植模型；每组所有小鼠的代表性肿瘤图像。平均肿瘤重量j个和肿瘤体积生长曲线k个用于指示细胞形成的肿瘤。我H&E和IHC染色显示PLCE1在体内诱导了ESCC细胞的侵袭性表型。比例尺，100 微米。微血管密度米表明PLCE1在体内促进对细胞凋亡和血管生成的抵抗。所有数据均以平均值表示 ± 标准偏差。*P（P） < 0.05,***P（P） < 0.001
图4
图4
PLCE1激活ESCC中的NF-κB信号通路。一实时PCR分析显示NF-κB依赖基因表达和PLCE1调节基因表达之间存在重叠。颜色表示PLCE1 shRNA载体与对照的强度，通过log2变换计算得出。b条对指示细胞中的指示蛋白进行Western blot。c（c）Western blot分析表明，PLCE1通过PI-PLCε通路通过PLCE1 shRNA、TPA和BIM影响NF-κB信号通路。d日ELISA分析显示PLCE1 shRNA、TPA和BIM对细胞内PI-PLCε-通路相关蛋白IP3和DAG水平的影响。e（电子）激光扫描共聚焦显微镜用于测量PLCE1 shRNA、TPA和BIM处理后ESCC细胞的细胞内钙荧光像素值，这对PI-PLC通路产生了正负效应。直方图显示荧光的半定量分析。（f）通过指定处理表达的ESCC细胞中NF-κB荧光素酶报告基因的活性。克指示细胞中的IκBα和p-IκAα（Ser 32）。小时48的影响 小时 0、2和10浓度的U73122处理对磷酸化p65（Ser536）蛋白水平的影响；ESCC细胞中的p65和IκBα。我转染shR-PLCE1的Eca109和EC9706细胞的IF分析。细胞被固定，用p65抗体（红色）和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（蓝色）染色，用适当的二级抗体培养，并用双重IF分析。j个Eca109和EC9706细胞的全细胞裂解物用针对所示蛋白的抗体免疫沉淀。k个ChIP分析Bcl2和VEGF-C基因上的p65结合位点。通过实时PCR评估招募范围
图5
图5
PLCE1通过体外激活ESCC中的NF-κB信号通路抑制凋亡并增强血管生成。一Bay11–7082以0、5、15浓度处理Eca109和EC9706细胞12、24和48 Western blot检测h.p-IκBα（Ser32）表达。b条用shR-PLCE1或/和Bay11-7082以指定浓度处理Eca109和EC9706细胞，处理时间为0、24、48、72和96 h.通过MTT测量细胞活力，并将其表示为三个独立实验的平均值±SD。c（c）用shR-PLCE1或U73122或/和Bay11-7082处理的细胞的FITC–PI染色，三个独立实验的结果均为±SD。d日按指定浓度处理的细胞的TUNEL染色。e（电子）用shR-PLCE1或U73122或/和Bay11–7082处理Eca109和EC9706细胞，然后进行JC-1染色分析。（f）通过Western blot检测shR-PLCE1和Bay11-7082对凋亡相关蛋白的影响。β-肌动蛋白为负荷对照。克刺激后进行MTT测定，如图所示。小时细胞中的管形成。我代表性图像和j个transwell基质渗透试验中指示细胞侵袭细胞的定量。条形表示平均值 ± 三个独立实验的SD。*P（P） < 0.05,**P（P） < 0.01,***P（P） < 0.001.k个VEGF-C蛋白的表达与指定的处理方法，以及使用Western blot的细胞
图6
图6
PLCE1通过激活体内ESCC中的NF-κB信号通路增强血管生成并抑制凋亡。一裸鼠异种移植模型；第14天和第25天所有小鼠的肿瘤图像。体重b条，肿瘤体积生长曲线c（c）,d日和平均肿瘤重量e（电子）用于指示细胞形成的肿瘤。（f）生存，克裸鼠组织中p-IκBα（Ser32）、Bcl-2和VEGF-C的表达。h、 我H&E和IHC染色和IF证实PLCE1在体内诱导ESCC细胞的侵袭性表型，Bay11-7082可以逆转这一现象。HE:比例尺，5 毫米；PLCE1，p65，Ki-67，CD34，比例尺，100 微米；Bcl-2，比例尺，50 微米
图7
图7
PLCE1诱导的ESCC NF-κB活化的临床相关性。一,b条在368例原发性人类ESCC标本中，PLCE1与NF-κB分子表达相关。比例尺，100 微米。c（c）IκBα、IKK和p65低表达与高表达食管鳞癌患者的Kaplan-Meier曲线；(P（P） = 0.115 × 10− 三,P（P） = 0.612和P（P） = 分别为0.715，log-rank测试）d日 PLCE1号机组mRNA表达与IKKα、IKKβ、Bcl2L1和血管内皮生长因子已发表的食管鳞癌基因图谱中mRNA表达和IκBαmRNA表达阴性(n个 = 198;P（P） < 0.05; 食管癌TCGA数据库）。e（电子）拟议模型。ESCC中涉及PI-PLCε-NF-κB信号通路的调控途径的示意图模型。PLCE1激活PI-PLCε-NF-κB信号通路，增强血管生成，抑制凋亡，从而导致ESCC的进展
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