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.2019年7月；61(1):86-96.
doi:10.1165/rcmb.2018-0121OC。

心肌素参与人胸膜间皮细胞的间皮-间充质转化

托里·塔克 1, 津崎吉贺 1, 酒井俊史 1, 三桥信雅 1, 小松佐治 1, 安·杰斐斯 1, 史蒂文·伊德尔 1, 池部三雄 1
附属机构

肌球蛋白参与人胸膜间皮细胞的间皮-间充质转化

托里·塔克等。 Am J Respir细胞分子生物学. 2019年7月.

摘要

胸膜纤维化的特征是胸膜间隙严重炎症和胸膜重组。随后内脏胸膜增厚导致肺僵硬和肺功能受损。胸膜间皮细胞（PMC）可以成为肌成纤维细胞通过间皮-间充质转化（MesoMT）并有助于胸膜组织、纤维化和外皮形成。然而，MesoMT背后的机制仍不清楚。在这里，我们研究了心肌蛋白在介孔MT诱导中的作用。转化生长因子β（TGF-β）和凝血酶诱导了人PMC（HPMC）中的MesoMT，并显著上调了心肌蛋白的表达，但未上调心肌蛋白相关转录因子A（MRTF-A）或MRTF-B的表达。TGF-β刺激显著诱导HPMC中肌球蛋白的核转位，而未观察到MRTF-A和MRTF-B的核转位。在接受MesoMT的细胞中，受心肌蛋白控制的几个基因上调，这种效应伴随着HPMC的细胞骨架重组，与迁移表型一致。肌卡蛋白基因沉默阻断TGF-β和凝血酶诱导的MesoMT。虽然心肌细胞的上调被阻断，但MRTF-A和MRTF-B没有改变。在炭黑/博莱霉素增厚胸膜和纤维性胸膜损伤的脓胸小鼠模型中，肌球蛋白、α-SMA、钙粘蛋白和平滑肌肌球蛋白显著上调。在人类非特异性胸膜炎中也观察到类似结果。在TGF-β小鼠胸膜纤维化模型中，PMC-特异性敲除心肌蛋白可防止肺功能减退。此外，PMC-特异性心肌炎基因敲除可消除TGF-β诱导的胸膜增厚，与floxed-mycardin对照组相比，伴随着心肌炎、钙粘蛋白和α-SMA表达的显著降低。这些新结果表明，心肌蛋白参与HPMC中MesoMT的发展，并参与胸膜组织和纤维化的发病机制。

关键词：间皮-间充质转化；心肌蛋白；胸膜纤维化；平滑肌；α-平滑肌肌动蛋白。

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数字

图1。
图1。
转化生长因子β（TGF-β）和凝血酶对间皮-间质转化（MesoMT）期间心肌蛋白及其控制下基因表达的影响。(A类)接受MesoMT的细胞中平滑肌标记基因的上调。通过定量PCR（qPCR）分析测定TGF-β（5 ng/ml）和凝血酶（13 nM）刺激诱导的MesoMT过程中平滑肌标记基因（α-平滑肌肌动蛋白[α-SMA]、平滑肌肌球蛋白重链[sm-myosin]、高分子量钙化单体[h-caldesmon]和钙粘蛋白）的mRNA水平。表达水平归一化为对照组（PBS）。n个 = 3, **P（P） < 0.01和***P（P） < 0.001与PBS(B类)用TGF-β（5 ng/ml）和凝血酶（13 nM）处理人胸膜间皮细胞（HPMC）以诱导介导MT。通过SDS-PAGE解析细胞裂解物，并对α-SMA、钙视网膜蛋白和肌球蛋白进行免疫印迹。β-actin为负荷对照。(C类)TGF-β（5 ng/ml）和凝血酶（13 nM）诱导HPMC中的心肌蛋白，但不诱导心肌蛋白相关转录因子A（MRTF-A）或MRTF-B mRNA表达。用qPCR测定mRNA水平。n个 = 3, *P（P） < 0.05与PBS(D类)TGF-β和凝血酶诱导的HPMC细胞骨架变化。TGF-β（5 ng/ml，中间面板）和凝血酶（13 nM，底部面板）刺激后HPMC的共焦图像。上面板（PBS）显示无刺激的对照细胞。在TGF-β和凝血酶处理的细胞中，F-actin（青色）、α-SMA（红色）和sm-myosin（绿色）的表达增强。合并的图像包括细胞核（DAPI，蓝色）。比例尺：10μm；每张幻灯片30个字段；每次治疗三到四张幻灯片。
图2。
图2。
TGF-β在MesoMT期间诱导心肌细胞核移位。(A类)TGF-β（5 ng/ml）存在和不存在时HPMC中心肌定位的共焦图像。合并后的图像显示细胞核（DAPI，红色）和心肌蛋白（绿色）。箭头表示心肌细胞核定位区域（黄色）。(B类)在有或无TGF-β刺激的HPMC中MRTF-A（绿色）定位的共焦图像。合并图像显示细胞核（DAPI，红色）和MRTF-A(C类)在有或无TGF-β刺激的HPMC中MRTF-B（绿色）定位的共焦图像。合并图像显示细胞核（DAPI，红色）和MRTF-B信号。比例尺：20μm。
图3。
图3。
肌钙蛋白敲除对MesoMT期间肌钙蛋白和肌钙蛋白相关基因的影响。未转染、对照siRNA和心肌细胞siRNA转染细胞的血清饥饿24小时。然后用PBS、TGF-β（5ng/ml）或凝血酶（13nM）处理细胞48小时。(A类)细胞裂解产物通过SDS-PAGE进行解析，并对α-SMA进行免疫印迹。β-actin为负荷对照。显示了三个独立实验的代表性图像。(B类和C类)在TGF-β存在下，从对照细胞和心肌细胞siRNA转染细胞中分离出总RNA。(B类)通过qPCR分析测定肌球蛋白、sm22和钙调素mRNA。表达标准化为对照siRNA处理细胞的mRNA水平为1.0*P（P） < 0.05和**P（P） < 0.01与对照siRNA(C类)通过qPCR分析测量心肌素、MRTF-A和MRTF-B的mRNA。将表达标准化为TGF-β处理的对照siRNA细胞的mRNA水平，值设置为1.0*P（P） < 0.05和**P（P） < 0.01与对照siRNA。数据表示为±SEM，n个 = 3-4个独立实验。(D类)小鼠PMC（MPMC）是从心肌组织特异性敲除（心肌细胞KO）和心肌细胞漂浮小鼠（对照）中分离出来的。然后用TGF-β（5 ng/ml）处理血清饥饿的细胞，并通过qPCR分析测定mRNA表达。PBS处理的MPMC的mRNA水平设置为1.0*P（P） < 0.05和**P（P） < 0.01与对照组。数据表示为±SEM，n个 = 3个独立实验。
图4。
图4。
心肌蛋白基因沉默对TGF-β和凝血酶处理的HPMC的细胞形态和肌动蛋白细胞骨架结构的影响。HPMC在玻璃盖玻片上培养。用对照组或心肌细胞siRNA转染细胞，然后用PBS、TGF-β或凝血酶处理。然后用免疫荧光成像检测F-actin（青色）、α-SMA（红色）和sm-myosin（绿色）的表达。合并的图像包括细胞核（DAPI，蓝色）。比例尺：10μm；每张幻灯片30个字段；每次治疗三到四张幻灯片。
图5。
图5。
人非特异性胸膜炎组织中心肌蛋白及其下游基因的上调。(A类)对正常人（左）和胸膜炎患者（右）的肺组织切片进行三色染色，以显示胶原沉积（蓝色）和胸膜结构的变化。(B类)对人胸膜组织切片进行免疫荧光染色，以检测胶原蛋白（绿色）、肌钙蛋白（红色）和钙蛋白（青色）。肌球蛋白和钙粘蛋白在胸膜炎组织中共存。与正常肺组织相比，胸膜炎组织中胶原表达增强。(C类)对人胸膜组织切片进行胶原蛋白（绿色）、α-SMA（红色）和肌球蛋白（青色）免疫荧光染色。胶原蛋白、α-SMA和sm-myosin在胸膜处共定位。白色箭头表示胸膜；每张幻灯片30个字段；每组四张幻灯片。比例尺：200μm。
图6。
图6。
小鼠两种纤维性胸膜损伤模型（炭黑/博来霉素[CBB]和脓胸）中心肌蛋白及其下游基因的上调。(A类)盐水处理、CBB处理和脓胸处理小鼠的肺组织切片进行三色染色，以显示胶原沉积（蓝色）和胸膜结构的变化。(B类)对小鼠胸膜组织切片进行免疫荧光染色，检测sm-myosin（绿色）、mycardin（红色）和细胞核（DAPI，蓝色）。肌球蛋白和肌球蛋白在CBB和脓胸处理的组织中共定位。(C类)对小鼠胸膜组织切片进行免疫荧光染色，以检测钙蛋白酶（绿色）、α-SMA（红色）和细胞核（DAPI，蓝色）。Calponin和α-SMA在CBB和脓胸处理的肺组织的胸膜共定位。白色实心箭头表示胸膜；每张幻灯片30个字段；每组三到四张幻灯片。比例尺：200μm。
图7。
图7。
Myocardin KO小鼠可防止TGF-β诱导的胸膜纤维化。Myocd公司飞行/飞行用编码增强型GFP（EGFP）或TGF-β的腺病毒载体治疗组织特异性心肌蛋白敲除（mycod KO）小鼠。(A类)7天后，测定肺功能（顺应性）。数据表示为±SEM，n个 = 每次治疗3-7只小鼠。(B类)7天后，从心肌组织切片飞行/飞行或肌瘤KO小鼠用编码EGFP或TGF-β的腺病毒载体治疗后，三色染色显示胶原沉积（蓝色）和胸膜结构改变。(C类)收集TGF-β腺病毒治疗小鼠的肺组织。对小鼠胸膜组织切片进行免疫荧光染色，检测细胞核（DAPI，蓝色）、钙粘蛋白（绿色）和α-SMA（红色）。顶部的两个面板：钙粘蛋白和α-SMA共同定位于TGF-β处理的心肌梗死小鼠胸膜中。底部两个面板：小鼠胸膜组织切片免疫荧光染色，检测细胞核（DAPI，蓝色）和心肌蛋白（红色）。TGF-β腺病毒治疗心肌梗死飞行/飞行小鼠胸膜增厚，α-SMA、心肌钙蛋白和钙粘蛋白表达较肌瘤KO小鼠增加；每张幻灯片30个字段；每组三到七张幻灯片。显示了具有代表性的图像。比例尺：50µm。不适用。 = 不重要。
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