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.2019年3月1日;316(3):F463-F472。
doi:10.1152/ajprenal.00181.2018。 Epub 2019年1月2日。

杂合Pkhd1C642型*小鼠出现囊性肝病和近端小管扩张,类似于髓质海绵肾的影像学征象

附属公司

杂合Pkhd1C642型*小鼠出现囊性肝病和近端小管扩张,类似于髓质海绵肾的影像学征象

丹山等。 美国生理学杂志肾脏生理学. .

摘要

人类多囊肾和肝病1(PKHD1)突变的杂合性最近与囊性肝病和类似髓质海绵肾(MSK)的影像学表现相关。然而,在携带Pkhd1基因陷阱或外显子缺失的杂合小鼠中,囊性肝病或肾病的缺乏减弱了这些相关性。为了确定较小Pkhd1缺陷的杂合性是否会在小鼠中引发囊性肾病,我们生成了预测截断Pkhd2的小鼠并对其进行了特征分析C642型*五种截断人类突变(PKHD1之间G617fs型和PKHD1G644型*). Pkhd1的小鼠杂合子或纯合子C642型*在他们出生后的头几周,核磁共振图像上的突变没有明显的肝脏或肾脏异常。然而,当年龄达到~1.5岁时,Pkhd1C642型*杂合子出现显著的囊性肝改变;组织分析显示,在Pkhd1中,胆道囊肿和胆管数量增加,但未出现先天性肝纤维化样门脉区炎症和纤维化的迹象C642型*纯合子。有趣的是,老年女性Pkhd1C642型*杂合子和纯合子发生了类似于MSK的放射变化。然而,这些变化对应于近端小管扩张,而不是MSK相关的集合管扩张。总之,通过证明囊性肝和肾异常是由Pkhd1杂合性触发的C642型*突变,为相关的人类关联研究提供了重要的验证。总之,这些研究表明,PKHD1突变杂合性(70个人中预测频率为1)是人类囊性肝疾病和MSK样表现的重要潜在原因。

关键词:CRISPR;Cas9核酸酶;PCLD;基因编辑;基因靶向;多囊性肝病。

PubMed免责声明

利益冲突声明

M.Mrug报告了大冢制药和赛诺菲提交工作以外的拨款和咨询费用。其他作者都没有任何利益冲突,无论是财务上的还是其他方面的,需要披露。

数字

图1。
图1。
设计和生成第1页C642型*模型。基于CRISPR/Cas9的方法用于第1页外显子20靶向,详见材料和方法。其中一只生成的小鼠具有Pkhd1约1926_1932delTGATTGG与截断突变相对应的第20外显子突变第1页C642型*.野生型第1页顺序(第1页重量)用于比较。这个第1页C642型突变对转录的影响是通过用位于基因外显子19和21的引物扩增获得的逆转录酶PCR产物(通过测序确认特异性)的缺失来证明的第1页重量控制(插入).
图2。
图2。
第1页C642型*基因分型。这种基于PCR的基因分型方法分两步进行。在第一步中,使用高分辨率毛细管电泳Qiagen QIAxel高级系统解析扩增片段,以区分第1页C642/C642*纯合子(和第1页+/+纯合子)和第1页C642型/+杂合子(左边). 单波段是从第1页C642/C642*纯合子,因为此样本中所有分析的PCR产物具有相同的序列。类似地,获得了一个单一波段第1页+/+纯合子,因为此样本中所有分析的PCR产物具有相同的序列。如果是第1页C642型*/+杂合子(或第1页C642/C642*第1页+/+DNA),两个不同片段的混合物导致形成了可视为多条带的异源双链。在第二步中第1页C642/C642*纯合子与第1页+/+纯合子。这是通过将纯合子的扩增片段添加到野生型的扩增片段中来实现的第1页+/+1:1比例纯合子及其Qiagen-QiaAxel高级系统分析(正确的).
图3。
图3。
年轻人缺乏肝脏影像学异常第1页C642/C642**纯合子和10-mo-old第1页C642型*/+杂合子。一个:有代表性的图像显示第1页C642/C642**第1页+/+出生后8天和14天的小鼠。B类:10个月大鼠肾脏和肝脏的MRI图像中,典型图像显示无放射异常第1页C642型*/+老鼠第1页+/+小鼠(mo,月)。
图4。
图4。
老年人第1页C642型*/+杂合子在肝脏和肾脏出现放射异常。在右肾上极水平获得的典型MRI图像提供了肝脏的视图(顶部)和肾动脉层面的图像(底部)显示双肾的横切面。这些图像表明,老年女性和男性第1页C642型*/+杂合子会出现影像学上的肝脏异常,从几个大的散在囊肿到大小不等的多个囊肿。相比之下,肝脏影像学异常在第1页C642*/C642*纯合子。与肝脏表现相反第1页C642型*/+在女性和男性中均观察到杂合性,仅在女性中观察到放射学上的肾脏异常,并且这些表现在第1页C642型*/+杂合子和第1页C642*/C642*纯合子。这些影像学变化与人类杂合子肾脏中发现的变化相似PKHD1系列突变(例如,ARPKD的父代患者1参考文献中;注意,人类肾脏包含多个金字塔,而小鼠肾脏相当于一个金字塔)。
图5。
图5。
老年人肝囊肿和胆管异常第1页C642型*/+杂合子。一个:代表性图片显示,老年女性和男性第1页C642型*/+杂合子形成孤立的肝囊肿以及胆管亚群的异常。这些变化包括门静脉扩张和门脉区胆管数量增加(门静脉可通过腔内红细胞识别;门静脉附近的膀胱重组结构为扩张的胆管)。几乎没有先天性肝纤维化的典型特征,如肝纤维化改变和门脉区炎性浸润。除囊性和胆管改变外,其余肝实质完好无损。将苏木精和伊红染色的肝组织放大4倍,获得顶面板。B类:细胞角蛋白19(CK 19)染色与老年女性和男性门静脉扩张和胆管数量增加一致第1页C642型*/+杂合子(比例尺,50μm)。
图6。
图6。
老年人先天性肝纤维化第1页C642/C642**纯合子。有代表性的图片显示,女性和男性第1页C642*/C642*纯合子形成了先天性肝纤维化(CHF)的主要特征,包括门静脉附近胆管数量增加(门静脉含有管腔内红细胞;其他囊状结构为扩张的胆管)。与人类CHF表现相似,该模型中的门脉区为纤维化,伴有明显的炎症浸润。用4倍放大镜获得顶部面板。
图7。
图7。
老年女性近端小管异位第1页C642型*/+杂合子。一个:有代表性的图片显示只有老年女性第1页C642型*/+杂合子导致肾小管扩张(如箭头所示)。左侧插图:这种扩张的例子;右侧插入:受影响较小的邻近肾组织。男性肾小管第1页C642型*/+杂合子看起来正常。左右插图:放大视图,显示扩张最大和扩张最小节段之间的最小差异。将苏木精和伊红染色的肾组织放大4倍,获得顶部面板;(插入比例尺,1 mm)。B类:使用水通道蛋白1(Aqp1;绿色)作为近端小管的标记,水通道蛋白2(Aqp2;红色)作为集合管的标记(标尺,50μm),分析观察到的扩张的近端小管起源。C类:Ki67染色反映的增殖率较低(约两个Ki67+每5×40场管状细胞;标尺,50μm)。D类:另外,第1页C642型*/+Arl13b和α-乙酰化微管蛋白(Ac-tubulin)染色显示,杂合性未导致肾小管初级纤毛的任何显著结构异常;(比例尺,50μm)。

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引用人

工具书类

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